衣康酸生产菌土曲霉耐受糠醛的机制研究

Itaconic acid has active chemical nature, and is an important bio-based platform compound. Compared to Saccharomyces cerevisiae for ethanol fermentation, Aspergillus terreus for itaconic acid production could metabolize xylose inherently and efficiently. Conversion of hemicelluloses to itaconic acid could improve the comprehensive utilization of all lignocelluloses components. The toxicity of inhibitors such as furfural to Aspergillus terreus was important for industrialization itaconic acid production from hemicelluloses. The program intends to breed a furfural tolerant Aspergillus terreus via domestication and mutation. By means of systems biology analysis including metabolomics, transcriptomics, proteomics and phospholipids genomics, the response mechanism of the original and tolerant Aspergillus terreus to furfural inhibition is compared from furfural conversion and stress response. According to studying oxidative/protein stress, gene expression related to RNA/protein synthesis and energy synthesis/electronic transfer, and cell morphology adjustment, the tolerance mechanism of Aspergillus terreus to furfural is revealed deeply. The successful implement of the program could provide theoretic basis for molecularly solving the inhibition of furfural to Aspergillus terreus.

衣康酸具有活泼的化学性质，是一种重要的生物基平台化合物。与传统乙醇发酵所用的酿酒酵母相比，衣康酸生产菌土曲霉最大优势就是具备天然的高效木糖代谢能力。以半纤维素为原料生产衣康酸，有助于提高木质纤维素资源的全组分利用。半纤维素水解液中糠醛等抑制物对土曲霉的毒性问题是限制半纤维素原料工业化生产衣康酸的重要因素。本项目拟通过驯化和诱变，选育出糠醛耐受性强的土曲霉。采用代谢组学、转录组学、蛋白质组学和磷脂组学等系统生物学手段，从糠醛转化和胁迫响应两方面比较原始和耐受菌株对糠醛抑制做出的应答机制；通过研究氧化/蛋白胁迫、RNA/蛋白质合成基因表达、能源合成/电子传递基因表达和细胞形态调整等，深入揭示土曲霉对糠醛的耐受机制。本项目的成功实施，预期可为从分子生物学水平上解决糠醛对土曲霉的抑制提供理论依据。

衣康酸被美国能源部列为十二种最具开发潜力的生物基平台化学物之一，以木质纤维素为原料利用生物发酵法能够降低衣康酸生产成本推动衣康酸的广泛利用。糠醛作为木质纤维素水解液代表性抑制剂对衣康酸生产菌土曲霉具有毒害作用。.以土曲霉GIM3.388为出发菌株，利用化学诱变方法筛选得到一株能够耐受高浓度糠醛的耐受菌株，其在液体土豆葡萄糖培养基中生长速率发生了显著的变化，与原始菌株相比，迟滞期和生物量均降低约一半。糠醛浓度在0.2~1.0 g/L的范围内，耐受菌株的糠醛降解能力均高于原始菌株，特别是在较低浓度糠醛（<0.6 g/L）耐受菌株糠醛降解能力远高于原始菌株。但是，在含有糠醛的发酵培养基中两菌株衣康酸生产能力没有发生明显变化。.利用透射电镜观察在含有糠醛和未含有糠醛的发酵培养基中耐受和原始菌株亚细胞结构的变化。透射电镜图像表明：诱变后，耐受菌株中线粒体的形态由椭圆变为椭圆且两端稍尖，脂滴的数量和体积均减少，囊泡增多。糠醛的加入使耐受菌株细胞切面由圆形变为不规则性状，增加了脂滴体积和数量的减少量，线粒体形态两端变的更加尖锐。利用苯酚硫酸法测定耐受菌株和原始菌株胞内糖含量发现，诱变后耐受菌株胞内总糖含量由0.353 mg葡萄糖/ mg细胞干重降低到0.275 mg葡萄糖/ mg细胞干重。.在土曲霉迟滞期后衣康酸生产前取样，利用气相色谱-质谱联用技术研究糠醛对土曲霉代谢水平影响。代谢组学分析共鉴定出645种细胞小分子代谢物，选择学生t检验的p值小于0.1同时OPLS-DA模型第一主成分的变量VIP值大于1的代谢物为差异代谢物。利用KEGG数据库（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）找到差异代谢物中映射到的代谢通路，并通过统计学分析手段对这些代谢通路进行分析，得到与糠醛耐受性相关的代谢通路有：β-丙氨酸，赖氨酸，谷胱甘肽和色氨酸代谢通路。原始菌株通过上调胞内β-丙氨酸，谷胱甘肽和色氨酸代谢通路的活性，同时下调赖氨酸代谢活性以抵抗糠醛对细胞的毒害作用。