内源性逆转录病毒元件转录激活调控山羊早期胚胎发育的功能研究

Transcriptional activation of specific endogenous retroviruses (ERVs) is critical to maintain early embryonic development. The incomplete reprogramming and insufficient transcriptional activity of ERVs-related sequences is an important factor leading to abnormal development of cloned embryos. At present, the functions and mechanisms of ERVs components and their transcripts in regulating embryonic development are yet unclear. In the early stage of this project, we obtained the activated ERVs and related lncRNA by blasting the early embryonic transcriptome with all ERVs sequences in the goat genome. On the basis of this finding, this project will establish the ERVs sequence knockout cell line using CRISPR-Cas9 system, construct the cloned embryos by somatic cell nuclear transfer, and study the regulation functions of potential promoters and enhancers in the ERVs sequences on embryonic development. Screening the essential lncRNAs for early embryonic development by loss- and gain-of-function experiments and analyzing the target genes and pathways to determine the functions of ERVs-derived lncRNA. This proposal will clarify the biological functions of ERVs in regulating goat early embryo development from the two levels of cis-acting and trans-acting. The findings of this project is great significance to reveal the mechanism of goat embryo development and improve the efficiency of somatic cell nuclear transfer technology.

特定内源性逆转录病毒(ERVs)元件转录激活对维持早期胚胎发育十分关键，ERVs相关序列重编程不彻底和转录活性降低是导致克隆胚胎发育异常的重要因素。目前，ERVs元件及其转录产物调控胚胎发育的功能和机制尚未阐述清楚。本项目前期通过将早期胚胎转录组数据与山羊基因组中所有ERVs序列进行双向比对，筛选到了合子基因组激活过程中高效表达的ERVs元件及其转录的lncRNA。在此基础上，本项目拟利用CRISPR-Cas9系统建立ERVs调控序列敲除细胞株，利用体细胞核移植技术构建克隆胚胎，研究ERVs序列中潜在启动子和增强子对胚胎发育的调控功能；通过功能缺失和功能获得实验，筛选早期胚胎发育必须的lncRNA，并研究其调控的靶基因和通路，明确ERVs来源lncRNA的功能。从顺式作用和反式作用两个层面，阐明ERVs调控山羊早期胚胎发育的功能，对揭示山羊胚胎发育调控机制，提高体细胞克隆效率有重要意义。

特定内源性逆转录病毒(ERVs)元件转录激活对维持早期胚胎发育十分关键，ERVs相关序列重编程不彻底和转录活性降低是导致克隆胚胎发育异常的重要因素。目前，ERVs元件及其转录产物调控胚胎发育的功能和机制尚未阐述清楚。本项目主要研究山羊基因组中重要ERV元件及其转录产物调控山羊早期胚胎发育的功能。获得如下研究结果：（1）建立山羊转座子序列数据库，山羊ERVs类元件约占基因组的28.4%，最显著的特点是ERV1元件包含12366个拷贝，占基因组比例的24.0%；（2）利用转录组测序技术分析了山羊早期胚胎转录组，证明在8-细胞时期发生转录本大量被转录，胚胎基因组被激活，其中ZSCAN等典型胚胎基因在山羊早期胚胎发育过程中也符合合子基因激活特征；（3）ERV1、LINE1和RTE类元件在山羊早期胚胎中呈现阶段特异性表达，挑选的两类母系基因和胚胎基因表达模式的ERV1类元件，干扰敲降表达后，山羊早期胚胎囊胚发育率显著下降（22% vs 7%，P < 0.05）；（4）分析IVF-8c、IVF-2c和SCNT-8c差异表达基因，得到了12条差异表达lncRNAs，RT-qPCR定量分析显示lncRNA3720在IVF-8细胞期高表达，干扰试验证明lncRNA3720敲低显著降低了囊胚发育率（P < 0.05），lncRNA3720可以调节合子基因ZSCAN4、EIF1AX的表达；核移植胚胎补偿试验证明，lncRNA3720的过表达可提高核移植胚胎的发育率（P < 0.05）；（5）lncRNA5926在胚胎基因组激活时期高表达，下调lncRNA5926水平显著降低囊胚发育率，通过敲低和过表达实验证明lnc5926对合子基因组激活基因Zscan4和Eif1ax具有重要调控功能；利用免疫荧光染色实验和Western Blot技术分析，结果表明过表达lnc5926能够降低胎儿成纤维细胞基因组H3K9 me3的水平，提高基因组H3K9 Ac的水平。本项目筛选出对山羊早期胚胎发育有重要作用的ERVs元件及相关的lncRNAs，验证ERVs元件中潜在调控序列与靶基因的相互作用，以及调控胚胎发育的功能，分析lncRNA调控胚胎发育的靶基因，揭示了ERVs调控山羊早期胚胎发育的生物学功能。本课题的实施揭示了山羊胚胎早期发育特有的调控机制，对提高山羊体细胞克隆技术的效率有重要意义。