Tet3蛋白在山羊早期胚胎DNA甲基化重编程过程中的作用

DNA demethylation is a crucial step during embryonic development and somatic cell reprogramming processes. Ten-eleven translocation (Tet3) protein, a key enzyme for active demethylation of paternal pronucleus in mouse zygote, is essential to activate the expression of pluripotency genes for maintaining the embryonic development. The mechanism of DNA demethylation in goat embryos is defferent from in mouse, and it is still unclear. In addition, incomplete DNA demethylation prevalently takes place in the cloned embryos. The purpose of the project is to investigate the effects of Tet3 protein on the active demethylation of goat early embryo development, and explore whether the Tet3 protein can improve the DNA methylation reprogramming process of cloned embryos. The expression level of Tet3 will be silenced by RNA interfering technique, and the levels of 5mC and 5hmC in genome-wild and specific loci in genome will be eximined after intracytoplasmic sperm injection. Tet3 protein will be overexpressed in somatic cells by transfection with an inducible expression vector. The levels of 5mC and 5hmC in genome-wild and specific loci in genome and the expression level of pluripotency and imprinring genes of cloned embryos will be eximined after nuclear transfer. The findings ot this proposal will demonstrate the the roles of Tet3 protein in the process of DNA methylation reprogramming of goat early embryos, whick is important for revealing the mechanisms of DNA demethylation in goats, and for promoting the reprogramming efficiency of cloned embryos.

DNA去甲基化是胚胎发育和细胞重编程过程中的重要环节，Tet3蛋白作为小鼠受精卵雄原核主动去甲基化的关键酶，是胚胎发育所必须的蛋白因子。山羊早期胚胎去甲基化模式与小鼠不同，去甲基化机制尚不清楚，而且克隆胚胎普遍存在DNA去甲基化不完全现象。因此，本课题拟研究Tet3蛋白在山羊早期胚胎DNA主动去甲基化过程中的作用，并探究Tet3蛋白能否提高克隆胚胎DNA甲基化重编程效率。项目拟通过RNA干扰技术下调卵母细胞中Tet3蛋白表达，显微受精后检测胚胎全基因组和特定位点5mC和5hmC的水平；利用诱导型表达载体控制Tet3蛋白在体细胞中表达，核移植后检测克隆胚胎全基因组和特定位点5mC和5hmC的水平，并检测相关基因的表达，从而确定Tet3蛋白对山羊早期胚胎DNA甲基化重编程的作用。本课题的实施对揭示山羊早期胚胎DNA甲基化重编程机制，提高动物克隆效率有重要意义。

本项目研究了Tet3蛋白对山羊早期胚胎DNA甲基化重编程的作用，探索体细胞过表达Tet3对克隆胚胎发育的影响。获得如下结果：（1）山羊Tet3基因的克隆和分析。利用无缝克隆技术分段扩增，获得了Tet3 CDS全序列。分析Tet3蛋白序列和结构，证明该蛋白与小鼠Tet3具有相似的功能结构域；（2）Tet3对早期胚胎DNA去甲基化和基因表达的作用。利用RNA干扰下调卵母细胞中Tet3表达，通过显微注射制备体外受精胚胎。免疫荧光染色结果显示，正常受精胚胎去甲基化发生在2-4细胞过渡期，而且羟甲基化与甲基化变化模式一致，没有发现甲基化向羟甲基化转化的现象，干扰Tet3表达导致2-4细胞胚胎不发生甲基化和羟甲基化降低的过程。利用OX-BS分析各组囊胚，结果显示下调Tet3表达胚胎Oct4、H19、 Igf2r和Nanog的5mC水平升高，其中Nanog显著升高，5hmC的水平变化不显著。定量PCR结果表明，下调Tet3的表达显著降低囊胚Nanog的表达量；（3）体细胞表达Tet3蛋白对全基因组和特定基因位点5mC和5hmC水平的影响。构建诱导型的Tet3蛋白真核表达载体pTET-BI-GFP，制备转Tet3基因细胞株21个，利用Dox诱导Tet3蛋白表达，过表达Tet3可以显著降低成纤维细胞全基因组和特定位点上的甲基化水平，提升羟甲基化水平，显著提高多能基因Nanog和Oct4的表达量；（4）体细胞表达Tet3蛋白对克隆胚胎重编程效率的影响。以稳定高表达Tet3的转基因细胞株为供核体，构建克隆胚胎(Tet3-SCNT)，Tet3-SCNT胚胎体外发育率显著高于Control-SCNT组，全基因组5mC和5hmC的水平显著低于Control-SCNT组。Control-SCNT组Oct4和Nanog启动子5mC水平显著高于IVF组，Tet3-SCNT组Oct4、Sox2、 Igf2r和Nanog的5mC水平均显著降低Control-SCNT组，与IVF相似，各组囊胚5hmC的变化不显著。本研究结果表明，山羊Tet3在早期胚胎DNA去甲基化、激活基因表达过程中发挥作用，体细胞表达Tet3可以降低基因组甲基化水平，提高多能基因表达量，提高克隆胚胎体外发育能力。本研究结果为后续研究早期胚胎重编程机制，提高动物克隆效率有重要意义。