Stk38L蛋白激酶对Toll样受体介导的天然免疫反应的调节作用和机制研究

Toll like receptors (TLRs) recognize conserved microbial molecules and play pivotal roles in innate and adaptive immune responses.However， the exact mechanism of TLR signal transduction remains unclear. Our primary experiments showed that knockdown of Stk38L, (also called NDR2, codes for serine/threonine kinase 38-like protein) increases LPS-induced NF-κB and p38 activation and production of proinflammatory cytokine. In addition to constitutively combined with a 125KD protein, LPS induced Stk38L to interact with another 195KD protein which might be the target molecular of Stk38L.All this suggested that Stk38L might regulated TLR signal transduction through its specific target.In this project,we will investigate the role of Stk38L in regulation of TLR signalling pathway by gene knockout mouse. We will also try to find the target molecular by STK38L which inhibits TLR signaling by immune precipitation and mass spectrometry technology, aim to elucidate the mechanisms by which Stk38L regulates TLR signal transduction.

Toll样受体（TLR）是免疫细胞识别病原保守成分启动机体固有免疫反应的关键性分子，研究TLR信号传导及其调控机制对防治感染、肿瘤、自身免疫性疾病具有重要意义，但其机制仍未完全阐明。我们发现Stk38L蛋白激酶基因敲减增强LPS诱导的NF-κB和p38信号分子的活化以及炎症因子产生。免疫沉淀发现Stk38L组成性和诱导性结合不同分子量的蛋白，提示Stk38L可能通过其特定的靶分子负向调控TLR信号转导。本课题将采用免疫沉淀、质谱分析等技术，寻找Stk38L负向调控TLR信号的靶分子，明确STK38L通过靶分子对TLR的负调控机制。利用RNA干扰、基因敲除等手段，以TLR配体刺激、细菌感染（G+和G-细菌）为模型，从分子、细胞及动物整体水平探讨STK38L在TLR信号转导中的重要作用。本研究将从STK38L-靶分子这个新角度揭示TLR的信号转导和调控机制，为感染等疾病的防治提供新的思路。

炎性因子TNFα和IL-17在炎症和自身免疫病中起着重要的作用。NDR家族是进化保守分子，在中心体复制，细胞周期，自噬和凋亡过程中起着重要作用，但在炎症中的作用尚未明确。我们发现：.（1）在Hela细胞和HT-29细胞两种上皮细胞株，用RNA干扰敲减NDR2分子后发现，TNF-α-或IL-17诱导的 IL-6, CXCL2 和 CCL20 都明显增高，提示NDR2分子可能负性调控TNF-α-或IL-17诱导的炎症。.（2）在小鼠MEF细胞，我们发现：与NDR2+/+ MEF相比，NDR2-/- MEF在TNF-α-或IL-17单独刺激或联合刺激都会产生更多的 IL-6, CXCL2 和 CCL20。.（3）在上皮细胞特异敲除NDR2的小鼠，我们建立了TNFα或IL-17诱导的急性肺损伤模型。与野生型小鼠相比，NDR2-/-小鼠肺泡灌洗液（BALF）中的炎症因子和趋化因子明显高；浸润的Gr+CD11b+中性粒细胞也更多。提示NDR2在TNFα或IL-17诱导的肺损伤中起着负性调控作用。.（4）在溃疡性结肠炎病人，我们发现肠黏膜中NDR2表达增高。.（5）在上皮细胞特异敲除NDR2小鼠，我们建立了DSS诱导的自身免疫性肠炎模型。发现与野生型小鼠相比，NDR2-/-小鼠表现出更严重的肠道损伤：结肠长度缩短更明显；肠黏膜损伤更显著；中性粒细胞的浸润更多，肠组织产生的炎症因子水平更高。提示NDR2对自身免疫性肠炎具有保护作用。.（6）在Hela细胞敲减 NDR2后发现IL17诱导的 ERK1/2 和 NF-κB p65的活化及TNFα诱导的JNK1/2 和 p38的活化明显增强。在NDR2敲减 MEF细胞上也得到了相似的结果。表明，NDR2通过抑制ERK1/2 、NF-κB p65和JNK1/2 、p38的活化来抑制TNFα和IL-17诱导的炎症。.（7）免疫沉淀证实IL-17可增强NDR2和MEKK2分子的结合。过表达Smurf1和NDR2抑制MEKK2的表达，而敲减Smurf1和NDR2则增强MEKK2的表达。NDR2 过表达则呈剂量依赖性地 增强K48-连接的 MEKK2的泛素化水平。表明，NDR2通过增强 MEKK2 泛素化来调控MEKK2的表达。.（8）为探讨Smurf1在其中的作用，我们在Hela细胞敲减Smurf1发现：TNFα和IL-17诱导的IL