片仔癀对骨肉瘤多药耐药性影响的实验研究

骨肉瘤是常见的一种骨源性恶性肿瘤，治疗失败的主要原因是肿瘤细胞多药耐药性的产生，寻找高效、低毒、作用靶点广泛的肿瘤耐药逆转剂，是肿瘤治疗的一个重要目标。前期的研究表明，片仔癀具有多靶点调整、低毒等作用。.故本课题以骨肉瘤细胞株U2OS、U2OS/DOX 为研究对象，采用MTT比色法及PI单染色法观察片仔癀对骨肉瘤多药耐药细胞生长增殖的影响；体外细胞毒试验及FCM法测定细胞对Rh123的积聚和外排观察该药对多药耐药性的逆转作用，并进一步探讨其作用与MDR1表达产物P-糖蛋白及凋亡抑制蛋白Surviving蛋白的关系。从而为临床应用片仔癀逆转骨肉瘤多药耐药性提供理论依据和实验基础。

摘要：多药耐药性的存在一直是骨肉瘤治疗的瓶颈问题，寻找有效的逆转剂成为目前骨肉瘤治疗研究的热点。具有“清热解毒、消肿散结、活血散瘀”功效的片仔癀，在临床应用中证实本品可起到扶正固本，提高机体免疫力，化疗增效的作用。本研究在此基础上，以骨肉瘤细胞株U2OS及其阿霉素耐药株U2OS/ADM为研究对象，采用MTT法、流式细胞术、RT-PCR、Western-blot 等方法，探讨片仔癀体外逆转骨肉瘤多药耐药性的作用及机制。.（1）耐药株的建立：采用阿霉素浓度梯度递增间隙作用法、大剂量间隙作用法建立了人骨肉瘤U2OS耐药株U2OS/ADM1、U2OS/ADM2。检测耐药指数、耐药稳定性、耐药谱及相关耐药基因，发现这两种耐药株耐药性稳定，具有多药耐药性，其耐药性与膜转运蛋白转运蛋白P-gp 、MRP1高表达及抑制细胞凋亡有关。U2OS/ADM1耐药性更为明显，提示临床应用化疗药物治疗骨肉瘤时应足量应用化疗药物，以防小剂量应用更易产生耐药性。后续实验以耐性明显的U2OS/ADM1为研究对象，观察片仔癀对其耐性的作用。.（2）片仔癀可明显抑制U2OS/ADM1细胞增殖，提高其对化疗药物的敏感性，逆转其对化疗药物的耐药性。MTT检测示片仔癀能够明显抑制U2OS及U2OS/ADM1的增殖，且U2OS、U2OS/ADM1 IC50无明显差异（P＞0.05），说明骨肉瘤耐药株对片仔癀无耐药性。对细胞无毒性作用的片仔癀药物浓度（0.4mg/ml）与ADM、PTX、DDP共同干预，能够明显提高U2OS/ADM1对ADM、PTX、DDP等化疗药物的敏感性。.（3）不同浓度片仔癀作用U2OS/ADM148h后，FCM 检测细胞凋亡及细胞周期、罗丹明-123外排；RT-PCR检测P-gp 、MRP1、BCRP、SurvivinmRNA，Western Blot法检测P-gp 、MRP1、BCRP、Survivin蛋白。发现片仔癀在体外能够有效逆转U2OS/ADM1对ADM的耐药，其机制包括促进凋亡、增加Caspase-3活性，下调膜转运蛋白P-gp 、MRP1、BCRP的表达，减少化疗药物的外排，增加细胞内化疗药物浓度。