片仔癀干预骨肉瘤干细胞ABC转运蛋白及PI3K/AKt信号通路逆转耐药的机制研究

Multidrug resistance (MDR) is the bottleneck problem in clinical for the treatment of osteosarcoma. The generation of MDR is related with many mechanisms. Recently researches show that the cancer stem cells (CSCs) play a critical role in the MDR of osteosarcoma , effectively kill the osteosarcoma stem cells or differentiate them to eliminate will become a breakthrough point for the reversal of the osteosarcoma MDR. Based on the theory of TCM toxin is the reason for the malignancy. Our preliminary studies confirmed Pien Tze Huang reverse the osteosarcoma MDR by suppressing the osteosarcoma drug-resistant strains U2OS/ADM proliferation, increasing Caspase-3 activity, decreasing the ABC membrane transport proteins ABCB1, ABCC1 expression, inhibiting of the expression of anti-apoptotic gene Survivin and Livin. Based on that results, we will investigate the effect of Pien Tze Huang on the U2OS/ADM SP cells, the expression of ABC membrane transport proteins and the phosphatidylinositol 3 kinase/serine-threonine kinase (PI3K/AKt）signaling pathway associate genes, in vitro and vivo ,to reveal the further mechanisms of Pien Tze Huang reverse the osteosarcoma MDR, and provide the experimental basis for clinical application.

骨肉瘤多药耐药性（Multidrug resistance，MDR）是目前临床治疗的一个瓶颈问题。MDR产生与多种机制有关，近期发现肿瘤干细胞（Cancer stem cells，CSCs）在骨肉瘤MDR中占有重要地位，有效杀伤骨肉瘤干细胞或使其得以分化、消除，将成为逆转骨肉瘤MDR的一个突破点。本课题以中医从"毒邪"论治恶性肿瘤为依据，在前期研究证实传统中药片仔癀通过抑制骨肉瘤耐药株U2OS/ADM 增殖，增强Caspase-3 活性，下调ABC 转运蛋白ABCB1、ABCC1的表达，抑制 Survivin、Livin 等抗凋亡基因的表达，逆转骨肉瘤MDR的基础上，通过体外体内实验观察片仔癀对骨肉瘤干细胞的作用及对骨肉瘤干细胞ABC转运蛋白、PI3K/AKt信号通路的调控作用，进一步揭示片仔癀逆转骨肉瘤的MDR的作用机制，为临床提供实验依据。

骨肉瘤多药耐药性（Multidrug resistancez，MDR）是目前临床治疗的一个瓶颈问题。MDR产生与多种机制有关，近期发现肿瘤干细胞（Cancer stem cells，CSCs）的存在在骨肉瘤MDR中占有重要地位，有效杀伤骨肉瘤干细胞，将成为逆转骨肉瘤MDR的一个突破点。前期研究表明片仔癀能够增加骨肉瘤阿霉素耐药株对化疗药物的敏感性，通过下调ABC膜转运蛋白表达，降低凋亡抑制基因的表达起到逆转骨肉瘤多药耐药的作用。在前期工作基础上，采用化疗药物阿霉素体外大剂量间隙作用法诱导建立骨肉瘤MG63/ADM耐药株，通过无血清悬浮法分离MG63/ADM细胞中的肿瘤干细胞，并鉴定其干细胞特性；以ABC膜转运蛋白及PI3K/Akt 通路为研究指标，探讨肿瘤干细胞与骨肉瘤耐药的关系，及片仔癀对肿瘤干细胞ABC膜转运蛋白及PI3K/Akt通路的影响，深入揭示片仔癀逆转骨肉瘤耐药的作用机制。. 研究结果：（1）采用化疗药物阿霉素体外大剂量间隙作用法成功诱导建立了骨肉瘤MG63/ADM耐药株，通过无血清悬浮培养获得第3代细胞球。通过细胞克隆形成能力、单细胞成球能力及细胞分化能力、裸鼠成瘤能力检测；激光共聚焦检测干细胞标志物SOX2、Oct-4、Nanog，证实第3代细胞球具有肿瘤干细胞的特性。（2）第3代细胞球细胞对阿霉素高度耐药，同时高表达ABC膜转运蛋白ABCB1、ABCG2，且p-Akt的表达在第3代细胞球细胞明显较MG63、MG63/ADM细胞增高，说明ABCB1、ABCG2及PI3K通路与肿瘤干细胞的耐药性相关。（3）片仔癀可以明显抑制第3代细胞球细胞的生长，抑制ABCB1、ABCG2蛋白的表达，并可调控PI3K/Akt信号通路相关因子的表达，逆转耐药。（4）成功建立了第3代细胞球细胞裸鼠皮下移植瘤模型。片仔癀与阿霉素联用对裸鼠移植瘤体积抑制率、重量抑制率明显高于单独使用片仔癀或阿霉素，表明片仔癀与阿霉素联用抗肿瘤效果明显优于单独使用片仔癀或阿霉素。其抑制作用与下调ABCB1、ABCG2蛋白的表达及调控PI3K通路相关因子有关。.片仔癀通过下调ABCB1、ABCG2蛋白表达，调控PI3K/Akt通路相关因子的表达，抑制骨肉瘤肿瘤干细胞的增殖，逆转其耐药。