叶酸靶向星型阳离子聚合物载多烯紫杉醇及MMP-9 siRNA表达质粒治疗鼻咽癌的研究

The average 5-year survival rate of nasopharyngeal carcinoma（NPC）treated by single radiotherapy are lower,targeting chemotherapy or gene therapy is research hotspot for the treatment of NPC,but there are no research about combined targeting chemotherapy and gene therapy at present. Docetaxel(DOC)-β-Cyclodextrin（CD）-Poly-L-Lysine Dendrimers（PLLD）-folic acid(FA) inclusion compound adsorbing green fluorescent protein and MMP-9 siRNA expressing plasmid are used for combined targeting therapy of NPC in vitro and in vivo in the project.In the study,the composites preparation and identification of DOC-β-CD-PLLD-FA adsorbing plasmid, screening the best interference sequence of MMP-9 siRNA expressing plasmid, FR targeting capacity and targeting gene transfection efficiency of the composites to NPC in vitro and in vivo and its tissue distribution in tumor-bearing nude mice, and inhibition effect of the composites treating of NPC in vitro and in vivo, observing the expression of PCNA and MMP-9 and cell apoptosis in tumors and the tumors volume and weight are studied by chemical method、HPLC、RT-PCR and Western-blot、MTT assay、flow cytometry、Matrigel invasion test、Immunohistochemistry、TUNEL and so on.The purpose of research is to explore the feasibility and validity of targeted comprehensive treatment of NPC, and provide experimental basis for clinical application.

鼻咽癌（NPC）单纯放疗平均5年生存率较低，靶向化疗或基因治疗已成热点，但目前仍未见联合化疗及基因靶向治疗研究。本项目采用多烯紫杉醇-β-环糊精-树枝状聚赖氨酸-叶酸包合物吸附表达绿色荧光蛋白和MMP-9 siRNA质粒的复合物进行NPC联合靶向体内外治疗。本研究采用化学方法、HPLC法、RT-PCR及Western-blot法、MTT法、流式细胞术、Matrigel侵袭实验、免疫组化、TUNEL法等，研究吸附质粒的多烯紫杉醇-β-环糊精-树枝状聚赖氨酸-叶酸复合物的制备及表征；筛选最佳干扰序列的MMP-9 siRNA表达质粒；复合物在体内外对NPC叶酸受体的靶向能力及基因转染效率和在荷瘤裸鼠体内分布；以及复合物在体内外对NPC的抑制效应，并观察瘤块PCNA和MMP-9表达和细胞凋亡、瘤块体积及重量。探索靶向综合治疗方法的可行性和有效性，为临床应用提供实验依据。

近年来分子靶向共传递药物和基因技术因能达到增强效果，减少毒副作用，阻止耐药形成等优势而成为鼻咽癌(NPC)治疗的主要策略。基于此，本项目先通过点击化学方法设计合成了星型阳离子聚合物β-CD-PLLD，载体对DOC的载药量是13.2 μg/mg，与筛选出的最佳MMP-9干扰质粒pMR3有良好的结合及保护能力，细胞转染效率约26.5%，较PEI的基因转染效率为低。CD-PLLD/DOC/pMR3作用于NPC HNE-1细胞较单一载DOC或载pMR3的细胞生长抑制率及凋亡率明显增加，侵袭能力明显下降。该研究成果在Biomaterials刊物发表。荷HNE-1瘤裸鼠经尾静脉用药，该复合物抑瘤效果也较单一载DOC或载pMR3明显。我们进一步通过酰胺化反应制备了叶酸(FA)-CD-PLLD载体，核磁氢谱分析显示构建成功。体外分别经NPC叶酸受体(FR)阳性的HNE-1细胞和FR阴性的CNE-2细胞实验显示该载体通过分子靶向明显增加基因转染效率，FA-CD-PLLD/DOC/pMR3组较CD-PLLD/DOC/pMR3组的HNE-1细胞凋亡率明显增加，侵袭能力明显下降。经荷HNE-1瘤及CNE-2瘤同一裸鼠尾静脉注射靶向复合物，固相萃取HPLC分析，在肝肺心脾肾中DOC药物浓度随血液循环时间延长而衰减，脑组织中未检测出。瘤块中DOC浓度随血液循环时间延长而增加，HNE-1瘤中的浓度明显较CNE-2瘤为高。经尾静脉注射复合物转染24 h，在肝肺心脾肾中有GFP表达，在脑组织无表达，HNE-1瘤中表达明显较CNE-2瘤明显。FA-CD-PLLD/DOC/pMR3组HNE-1瘤的抑瘤效果较CD-PLLD/DOC/pMR3组明显，显示了良好的体内外肿瘤靶向协同抑制效应。该研究成果在Oncotarget刊物发表。本项目首次构建了一类生物相容性好，载药量较高及基因转染效率较好的分子靶向载体，其共载系列显示出良好的体内外分子靶向协同治疗效应，在肿瘤治疗方面具有重要的临床应用前景。.此外，在此基础上，申请人在国家自然基金资助下积极进行了一些新的探索性工作，如：制备了其他系列针对NPC的靶向纳米药物；针对肿瘤及炎症，构建了系列载药物/基因的水凝胶，显示了良好的缓释治疗效应，这些研究成果分别在Mater Sci Eng C Mater Biol Appl、J APPL POLYM SCI等刊物发表。