基于RORγt靶点的雷公藤内生真菌免疫抑制活性成分及其作用机制研究

It is the developing direction of autoimmune disease treatment to study the immunosuppressive drug aimming at Th17 and its cytokines. The inhibitors, of which are Th17 targeted to RORγt, are promising to be the most safe and effective therapeutic drugs. In our research, to isolate IL-17-suppressed and RORγt binding chemical constituents from the fermentation broth of endophytic fungi in Tripterygium wilfordii Hook. f. (TWHf), several column chromatographic techiques are used by bioactivity-guided fractionation. The separation process are directed by RORγt receptors binding and IL-17-suppressed assays. Then, the studies, of which are the transcriptional activity and mRNA expression level of RORγt, the differentiation of Th17, the inhibitive specificity to T cells and nuclear hormone receptors, are carried out in order to clarify the mechanisms of action and structure-activity relationships, and discover new inhibitors of RORγt receptors. This study are contributed to the discovery of immunosuppressive leading compounds from endophytic fungi in TWHf, and to establishing scientific foundation for the discovery of therapeutic agents which can attenuate autoimmune diseases.

针对Th17及相关细胞因子的免疫抑制药物研究是自身免疫性疾病治疗的发展方向。以转录因子RORγt为靶点的Th17抑制剂极有望成为最安全、有效的自身免疫性疾病治疗药物。本研究以IL-17表达抑制和RORγt受体结合实验为活性筛选方法，选择雷公藤内生真菌发酵液中具有IL-17表达抑制活性的菌株为研究对象，通过活性追踪，应用各种色谱分离技术分离其中能够抑制IL-17表达且与RORγt受体具有较强结合作用的化合物，并对其进行RORγt转录活性、mRNA表达水平，Th17细胞分化，核受体及T细胞抑制专属性等免疫抑制活性评价。阐明活性化合物的免疫抑制作用机制及构效关系，发现新型的RORγt受体抑制剂。本项目有助于从雷公藤内生真菌中发现作用机制明确的具有免疫抑制活性的先导化合物，进而为发现治疗自身免疫性疾病的药物奠定科学基础。

本项目以三株不同产地来源雷公藤植株的内生真菌为研究对象，经过菌株分离共得到42株内生真菌，经过免疫抑制活性筛选与化学筛选，最后确定5株菌株为最后的目标菌株。菌株经大规模发酵，离心得发酵液与菌丝体。大孔吸附树脂富集，有机溶剂提取、萃取处理得到粗提取物浸膏。粗提取物浸膏经快速硅胶柱色谱、开放式ODS柱色谱，Sephadex LH-20凝胶柱色谱，半制备型HPLC及重结晶等分离方法进行分离纯化，利用波谱技术（1D NMR，2D NMR，MS等）对分离获得的单体化合物进行结构鉴定。最后共得到确定结构化合物41个，其中8个化合物为不同菌株分离得到的重复化合物。通过活性跟踪实验测定粗流分IL-17表达量变化及单体化合物的RORγt融合蛋白的TAP-HPLC-DAD分析，显示2个化合物能够和RORγt蛋白结合。其中1个化合物进一步试验显示能够显著降低EAE模型小鼠脾脏细胞RORγt及IL-17 mRNA的表达量，并能够显著降低EAE模型小鼠脾脏细胞IL-17蛋白的表达量，表明该化合物能够通过拮抗RORγt功能进而减少IL-17的表达。共发表学术论文5篇，其中SCI源期刊论文2篇，中文核心期刊论文3篇。以上研究成果为后续免疫抑制活性先导化合物及候选药物的研究与开发提供了实验基础。