定点修饰的生物正交反应在基因编辑技术中的应用

Homology-directed repair (HDR) through CRISPR/cas9 is an important gene editing method and showed great therapeutic potential. However, HDR is limited by its low efficiency. To solve this problem, we intended to use an expanded genetic code strategy to site-specifically incorporate bio-orthogonal reactive amino acids into Cas9 proteins to afford a covalent Cas9-donor DNA conjugate. Such conjugation will bring the donor DNA to the cleavage site and effectively increase the local concentration for an enhanced HDR efficiency. In addition, we will explore the possibility of duo functionalities incorporation using an further improved expanded genetic code method, which will allow two mutually orthogonal reactive groups to be modified simultaneously onto Cas9 protein for a more enhanced HDR efficiency. Finally, with such a chemical biology tool, our goal is to apply this new technology to the precise genetic editing of T cells for CART therapeutics.

通过CRISPR/Cas9进行同源重组（HDR）是对基因进行编辑的重要手段，在生物医药领域展现出巨大的应用前景。然而目前HDR发生的频率过低，提高其效率是当前基因编辑领域的研究热点之一。本项目拟通过基因密码子扩展技术，对Cas9蛋白实现定点的生物正交修饰，将HDR的供体DNA与切割复合物实现共价交联，通过增加基因切割位点附近的供体DNA的有效浓度提高HDR的发生频率。在此基础上，我们拟开发蛋白定点双修饰技术，对Cas9蛋白进一步实现定点的双化学修饰，用两种不同的生物正交反应，将供体DNA与荧光分子同时精准修饰到Cas9蛋白上，进一步提高HDR效率。最后我们拟将该技术应用于T细胞的精准改造，为CART的免疫疗法提供新技术。本课题的特点是用化学手段（定点修饰的生物正交反应）来解决生物技术的难题（提高基因编辑中同源重组的效率），发挥化学生物学学科特色，最终实现基础科研与应用的有机结合。

CRISPR/Cas9基因编辑技术自报道以来发展迅速，为哺乳动物细胞及生物体内基因组操控提供了有效的手段。在基因发生双链断裂后，相较于随机且不可控的非同源末端连接，针对基因进行同源重组修复（HDR）在基因治疗领域展现出了巨大的应用前景。然而过低的HDR发生频率严重限制了其发展，因此根据项目申请书的要求，我们通过基因密码子扩展技术对Cas9蛋白进行定点修饰，通过引入含有二苯并环辛炔（DBCO）修饰的核酸供体与Cas9蛋白进行直接或间接偶联，有效提高了基因编辑区域供体DNA的浓度，成功将细胞水平HDR效率提升至10倍以上，同时实现了小鼠胚胎细胞中基因的高效敲入，为基因治疗及转基因动物的制备提供了技术基础。此外，我们通过将Cas9与crRNA共价缀合，有效缩短了基因编辑所需的RNA长度，进一步简化和降低了RNA合成的成本。另外，与Cas9相比，近年来新发展的Cas12a核酸酶因其具有高特异性与低脱靶率而备受关注，但其基因编辑效率较低，严重限制了其应用。针对这一问题，我们利用定点叠氮修饰的Cas12a核酸酶与5’端修饰DBCO的crRNA共价偶连，发展了高效的Cas12a基因编辑系统，为Cas12a系统的发展与应用奠定了基础。在此基础上，我们将其应用于定点整合CAR-T细胞及通用型CAR-T细胞的制备，高效制备了基因定点整合的新一代CAR-T细胞，为免疫治疗提供了有效的工具。该研究中所构建的多种基因编辑工具与平台对生物体内基因组高效操控具有重要的意义与价值。