基于重组鲎血因子和金磁纳米粒子的内毒素检测方法

Bacterial endotoxin can directly or indirectly lead to a series of physiological and pathological reactions of human body, which could be lethal and detrimental. The present clinical limulus test has two problems. On the one hand, the cost of LAL reagents prepared from limulus blood is high and the specificity of the reagents is affected by the non-specific reaction pathway in the limulus blood extraction; on the other hand, samples are required for interference test before the limulus test, which is cumbersome, time-consuming. On the basis of previous work, this project is aimed at developing an ultra sensitive, fast, safe, and effective endotoxin detection method based on recombinant limulus blood factors and gold magnetic nanopartcles. The research includes two parts. The first part is to produce recombinant limulus blood factors in insect cells by genetic engineering. The endotoxin detection reagents based on recombinant limulus blood factors will reduce the cost, improve the sensitivity and specificity. The second part is to use gold magnetic nanoparticles modified with lipopolysaccharide binding CES peptide to efficiently separate endotoxin from samples. With the extraction of endotoxin, the interference tests are unnecessary and the detection of the endotoxin would be more sensitive and effective. This research could help develop a novel endotoxin detection method for the clinical practice.

细菌内毒素能直接或者间接引发人体的一系列生理和病理反应，危害极大。临床上现有的基于鲎试验的内毒素检测方法有两个问题，一方面依赖鲎血液制备的鲎试剂，成本高昂，特异性不强；另一方面每个样品都需要进行干扰试验，操作繁琐，耗费时间。本项目在前期工作的基础上，开发基于重组鲎血因子和金磁纳米粒子的超灵敏、快速、安全、有效的内毒素检测方法。具体研究内容包括两方面，一方面，采用基因工程技术进行昆虫细胞发酵生产重组鲎血因子代替鲎试剂，降低了成本，提高了检测灵敏度和特异性；另一方面，合成了金磁纳米粒子，表面修饰有内毒素特异性结合活性的CES多肽，实现了内毒素与样品的彻底分离，后续检测无需进行干扰试验。通过本项目的实施，可以提高临床医生对内毒素相关疾病的快速、灵敏、高效检测能力，对于疾病治疗和深入开展内毒素的生物医学研究意义重大。

细菌内毒素是构成革兰氏阴性菌细胞壁的脂多糖成分。血液内毒素是内毒素血症的特异性指标，血液内毒素的定量检测对内毒素血症的早期诊断和治疗研究具有重要意义。此外，生物制品、药品和医疗器械生产过程的内毒素监测对于保证药品器械安全性具有十分重要的意义。目前内毒素检测的金标准是鲎试验，其存在两个问题：一是依赖鲎血液资源，对葡聚糖产生假阳性反应，价格昂贵；二是抗干扰能力差，容易受到血液和复杂生物样本干扰。为解决这些问题需要开发低成本、简单、快速、灵敏、特异的内毒素检测方法。.针对问题一，通过基因工程技术可以重组表达具有生物功能的鲎试剂中关键蛋白，用于开发与鲎试剂原理类似的检测技术，摆脱对鲎资源的依赖，同时不含有非特异性反应成分。针对问题二，通过特异性的内毒素识别元件可以开发非酶生物传感器，也可以用内毒素结合肽修饰的金磁纳米粒子实现先分离后检测。本论文基于基因工程重组鲎因子和金磁纳米粒子等，建立新的内毒素检测方法，解决目前内毒素检测中面临的一些问题，满足复杂样本内毒素检测的迫切需求，使得内毒素检测在临床能够真正发挥作用，同时进一步保障药品安全。.基于纯化重组鲎因子建立的动态荧光法内毒素检测方法灵敏度达到0.001 EU/mL，可以用于超灵敏内毒素检测；体外蛋白剪接系统成功制备出具有内毒素特异性结合功能的CES多肽可以用于复杂样品中内毒素去除；基于内毒素结合肽开发的生物传感器检测内毒素线性范围为0.1 - 50 EU/mL，检测灵敏度为0.1 EU/mL，成功应用该传感器用于人血浆样本和细胞培养基中内毒素含量分析；成功利用内毒素结合肽修饰的金磁纳米粒子实现了血浆内毒素先分离后检测，灵敏度达0.1 EU/ml，满足临床需求；基于多粘菌素B和银纳米颗粒间相互作用的内毒素检测技术可以实现2.5 – 17.5 nM范围内内毒素浓度检测，可以用于复杂样本中内毒素含量分析，具有重要意义。