内生菌促进滇重楼皂苷类活性成分积累的机理研究

This project will focus on endophytic fungi distribution and biodiversity of different growth years and developmental stage' Paris polyphylla var. yunnanensis by using a variety of techniques including microbiology, natural product chemistry and molecular biology et al. Then the changes of aseptic seedlings' inoculated by endophytic fungi steroid saponin content of different growth years and developmental stage will be surveyed in order to screen strains promoting saponins accumulation. Furthermore, different parts of the endophytic fungi' extract will be added to the aseptic seedlings, observing its effect on saponin accumulation and related gene expression. By these methods, the rules in promoting Paris polyphylla var. yunnanensis' steroidal saponin accumulation are expected to find out. The discovery of endophytic fungi' roles in Paris polyphylla var. yunnanensis will provide a scientific basis for its GAP planting process and lay the theoretical foundation for further clarifying the steroidal saponin biosynthesis process.

本项目拟采用微生物学、天然产物化学和分子生物学等领域的多种技术和方法，系统地研究不同生长年限及不同发育阶段的滇重楼内生真菌的分布情况和生物多样性。在此基础上进一步分离鉴定优势菌株，并通过优势内生菌接种无菌苗，跟踪检测不同生长年限及不同生育期的滇重楼甾体皂苷含量的变化，筛选促进皂苷类成分积累的菌株，并通过对筛选得到的内生菌进行培养，分离出不同的部位作为提取物添加到滇重楼无菌苗中，观测其对皂苷类物质合成积及相关代谢基因表达的影响，初步探讨内生真菌促进滇重楼甾体皂苷代谢物积累的规律，为滇重楼GAP种植过程中如何提高药效成分产量、开发内生菌根真菌资源提供科学依据，也为科学上进一步阐明甾体皂苷生物合成的过程奠定理论基础。

滇重楼是云南的道地药材，是一些重要中成药如云南白药、血宁胶囊、抗病毒颗粒、红药、热毒清等主要成分之一。长期以来无论是民间还是企业都是以野生重楼资源为原料，随着需求量的增加和不合理的采挖，使野生重楼资源日益减少。急需寻找一种可以高效生产和积累滇重楼主要成分皂苷类物质的新方法，以此来缓解人们的破坏性采挖对日益贫瘠的重楼野生资源造成的压力。我们进行了以下研究：在自育滇重楼自交群体的基础上，系统、深入地研究滇重楼不同生长阶段及不同生长年限的内生菌根真菌的分布情况和生物多样性特征，在此基础上分离筛选可以产生宿主甾体甾体皂苷或刺激宿主产生甾体皂苷的内生真菌，并对其中的刺激机制进行深入的研究，探讨内生菌促进宿主植物皂苷类物质积累规律。项目采用微生物学、天然产物化学和分子生物学等领域的多种技术和方法，通过研究不同生长年限及不同生长发育阶段滇重楼内生菌根真菌的分类及丰度，结合滇重楼化学成分的含量与种类的变化，分离、筛选出优势内生真菌菌株4株、内生细菌菌株5株；采用液体发酵等微生物学方法，结合高效液相和谱学分析等化学方法，对获得的菌株进行发酵培养，筛选能产生甾体皂苷类物质的菌株3株；将所得到的优势菌根菌株反接到滇重楼无菌苗上，通过测定接种与不接种内生菌根真菌条件下宿主植物甾体皂苷含量的差异变化，证明了所获得4株内生真菌对滇重楼次生代谢产物的诱导调控作用机制；通过比较测定接种与不接种内生菌根真菌条件下宿主植物不同生长年限及不同生长发育阶段根茎中与甾体皂苷合成相关的基因表达变化，证明了内生真菌对滇重楼次生代谢产物的诱导调控作用；项目共发表13篇论文，其中7篇SCI，申请专利4项（授权1项），培养硕士研究生4名。