隐孢子虫CypA对CD4+T细胞分化和功能的调控及其作用机制

隐孢子虫是机会致病性原虫，但其机会致病性的分子机制尚不清楚，本研究的目的是发现决定其机会致病性的基因并阐明其功能。由于CD4+T细胞减少的AIDS等免疫缺陷患者隐孢子虫易感，因此与CD4+T细胞相互作用的基因可能是隐孢子虫机会致病性的分子基础。我们通过生物信息学方法发现隐孢子虫编码分泌性亲环素(CypA)基因，人的CypA可调控CD4+T细胞功能，故推断隐孢子虫CypA能调控CD4+T细胞的分化和功能，作为宿主保护性分子促进对虫体的抑制和清除，导致在CD4+T细胞减少时才能迅速繁殖，因此是决定其机会致病性的关键基因。课题拟研究CypA的酶学活性、胞外分泌性和在虫体中的表达情况；研究CypA 调控CD4+T细胞亚群Th1/Th2/Th17/Treg的分化和功能，确定CypA细胞表面受体及信号转导。为解释隐孢子虫的机会致病性分子机制提供重要线索，为研究药物、疫苗和免疫干预提供新的候选分子。

隐孢子虫是机会致病性原虫，但其机会致病性的分子机制尚不清楚，该课题基于隐孢子虫全基因组序列，经过大量的生物信息学分析发现隐孢子虫分泌性亲环素 (CypA)可能具有免疫调控作用成为该虫机会致病性的分子基础，因此围绕隐孢子虫的分泌性蛋白亲环素 (CypA)对宿主免疫细胞功能的调控作用展开。通过巢式PCR成功获得了隐孢子虫CpCypA编码基因的DNA序列，该序列全长633bp，编码210aa，没有内含子，前面20aa为信号肽。成功表达了去除信号肽的CpCypA重组蛋白，并在Rosseta(DE3)中成功获得了可溶目的蛋白；确定了最佳诱导条件。成功构建真核表达载体并转染COS-7细胞，收集细胞和细胞培养上清，通过western确定在细胞中分泌性表达，并且是由其信号肽引导蛋白的分泌性表达。完成CypA蛋白的酵母双杂交工作，发现人Universal 酵母双杂交文库中共有15个蛋白与CypA相互作用，确定了相互作用蛋白。利用相关文献找出各种生物中隐孢子虫CyPA的基因序列，根据人类PPIA的关键功能位点，推断隐孢子虫CyPA活化CD4+T细胞的可能活性肽段，将PP-a、PP-b和PP-c继续作用THP-1细胞到96h，观察CypA功能肽段的作用效果。结果发现：与空白对照组相比，1uM和10uM的PP-a在48h可以显著地促进THP-1细胞的增殖；而PP-b从48h到96h可以持续地促进THP-1细胞的增殖，有效作用浓度范围为0.1uM～10uM，1uM PP-b对活化后的THP-1细胞具有促增殖作用，PP-c无任何促细胞增殖效果。CypA b肽（1uoml/L、10umol/L）在48h具有显著的促Jurkat细胞增殖作用。通过western发现PP-b多肽是通过影响ERK及JNK通路影响其对细胞功能的影响。研究中通过分子生物学、细胞生物学和免疫学方法初步得出隐孢子虫CypA蛋白对宿主免疫细胞功能的影响，对揭示隐孢子虫的机会致病性机制提出了新的思路。申请者与耶鲁大学传染病学部合作，已经成功的在果蝇S2细胞中在可溶性上清中表达了CypA，完成了17个细胞信号通路的筛选，有望在近期能取得重要结果，希望能在本研究的基础上进一步深化。国内外目前尚无从机会致病性角度对隐孢子虫进行研究的报道。