鲸类TLR基因家族的进化：净化选择还是正选择或平衡选择？

Toll样受体（Toll-like receptors,TLRs）是先天性免疫系统的关键分子，在诱导免疫应答和炎症反应中发挥重要作用，是先天免疫和获得性免疫应答的"桥梁"分子。但迄今为止，哺乳动物TLRs进化规律及其与适应的关系仍缺乏了解。鲸类祖先从陆地重返海洋并在不同水域扩散的过程中，面临着环境病原微生物的剧烈变化，所以是研究TLRs进化机制的理想动物类群。本项目拟通过鲸类不同类群及其他哺乳动物类群Toll样受体基因家族编码区序列的克隆及其进化遗传学和生物信息学分析，揭示鲸类在起源、分化和适应性辐射过程中TLRs的进化模式和驱动因素，一方面揭示鲸类起源与适应辐射的免疫遗传学机制，另一方面为理解哺乳动物先天性免疫系统的进化规律提供依据。

鲸类祖先从陆地重返海洋并完全适应水生生活的过程中面临着病原微生物的剧烈变化，所以免疫适应是其需要解决的关键问题之一。本研究选择在诱导免疫应答和炎症反应中发挥重要作用的Toll 样受体（Toll-like receptors, TLRs），从基因克隆和基因组水平两个层面上揭示了鲸类和其他哺乳动物TLRs进化模式：1）在10个TLRs的成员中，其中仅TLR5在四个鲸类和大西洋海象中出现了移码突变和提前终止密码子，可能变为了假基因，且在鲸类中出现了选择压力放松，推测鲸类TLR5可能出现了功能冗余；2）在鲸类其他的9个TLRs未鉴定出移码突变和提前终止密码子，提示可能为功能基因。选择压力分析表明除了TLR7 & TLR9未被2种ML方法（M8 & FEL & REL）检测到正选择位点，其他7个座位至少被2种ML方法鉴定的正选择位点有61个，其中有55个位点（90.16%）发生了激进的氨基酸改变，且它们分布在鲸类的整个进化谱系，提示鲸类从陆生到水生生境转变以及后来的适应性辐射过程中均出现了适应性进化。3）鲸类正选择位点标注到系统发育树中发现，细菌敏感型TLRs（TLR1, 2, 4, 6, 10）检测到鲸类受正选择的谱系显著多于病毒敏感型TLRs（TLR3, 7, 8, 9），提示在鲸类进化历程中细菌型的病原微生物带来压力大于病毒型的。4）除了鲸类，在哺乳动物的其他谱系如：食肉目祖先支（TLR1、TLR6）、海洋哺乳动物组合枝（TLR4）、马末端支（TLR4）、非洲兽祖先支（TLR4）、牛末端支（TLR6）和鼩鼱（TLR6）末端支等均检测到显著的正选择信号，提示不同哺乳动物适应不同的生境其先天免疫TLRs均产生了适应性进化，以应对复杂多样及多变的病原微生物。同时，我们也发现正选择主要集中在细菌敏感型的TLRs，而病毒敏感型的TLRs主要受纯化选择。5）功能实验表明在特异配体刺激后，瓶鼻海豚TLR4和TLR8信号通路下游产物IL8的表达量均显著低于牛的，提示鲸类及其近亲牛TLR4和TLR8对配体的敏感度不同。并且胞外域和胞内域重组实验表明这种敏感度差异主要是由于与病原体结合的胞外域区段引起的。另外，本研究鉴定出鲸类TLRs对配体敏感度低于其近亲牛，可能与海洋环境中病原微生物的结构与种类远低于陆地环境有关。因此，初步的功能实验表明鲸类TLR已经产生的适应性功能改变。