AprA蛋白通过降解NETs组分介导铜绿假单胞菌免疫逃逸的分子机制研究

The Gram-negative bacterium Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is a major opportunistic pathogen that can cause a wide range of severe infectious diseases. Neutrophils play an important role in clearance of P. aeruginosa. Despite of the classic functions such as phagocytosis and degranulation, Neutrophils can release the decondensed chromatin into the extracellular space to form neutrophils extracellular traps (NETs) that can trap and kill P. aeruginosa. In the previous study, we found that the alkaline protease (AprA) efficiently degraded the Cit-H3 and blocked the killing of P. aeruginosa mediated by NETs. The study in vivo showed that the aprA gene deficient stain was more sensitive to clearance compared with its parent strain. Therefore, our results represent that AprA may mediate the immune evasion of P. aeruginosa, which is dependent on the cleavage of the components of NETs. In this project, we will focus on the mechanism of the cleavage of NETs mediated by AprA. Moreover, we will try to explain the role of AprA in the pathogenesis of P. aeruginosa.

铜绿假单胞菌是一种重要的革兰氏阴性机会性致病菌，能够引发多种严重的感染性疾病。中性粒细胞在机体清除铜绿假单胞菌中发挥着重要的作用。除了经典的吞噬功能和脱颗粒作用，中性粒细胞通过一种新的死亡方式（NETosis）将染色质释放到细胞外形成细胞外网格（NETs）捕获和清除铜绿假单胞菌。我们发现铜绿假单胞菌分泌的碱性蛋白酶AprA能够降解NETs中的瓜氨酸化组蛋白3（Cit-H3），并能够抑制NETs对铜绿假单胞菌的杀伤。体内实验结果表明与野生型菌株相比，aprA基因缺失的菌株更容易被机体清除。因此我们研究结果提示AprA蛋白可以通过降解NETs相关组分，抑制NETs的杀伤功能，从而介导铜绿假单胞菌的免疫逃逸。本项目将在已有的工作基础上，通过一系列体内外实验，详细阐明AprA对NETs相关组分降解的分子机制和AprA对铜绿假单胞菌致病性影响，为抗铜绿假单胞菌感染提供新的理论基础和潜在的药物靶点。

铜绿假单胞菌是一种重要的革兰氏阴性机会性致病菌，能够引发多种严重的感染性疾病。 中性粒细胞在机体清除铜绿假单胞菌中发挥着重要的作用。除了经典的吞噬功能和脱颗粒作用 ，中性粒细胞通过一种新的死亡方式（NETosis）将染色质释放到细胞外形成中性粒细胞胞外诱捕网（Neutrophil Extracellular Traps，NETs）捕获和清除铜绿假单胞菌。我们通过构建突变和回复突变株，证实铜绿假单胞菌分泌的碱性蛋白酶AprA是该细菌导致的小鼠肺炎过程中的重要毒力因子，其并不影响NETs生成，也不影响BALF中性粒细胞募集及炎症因子水平，其毒力机制为能够降解NETs组分中的瓜氨酸化组蛋白3（Cit-H3）以及髓过氧化物酶（MPO）和未修饰的组蛋白，进而抑制NETs对铜绿假单胞菌的杀伤。同时我们在研究中发现AprA诱导机体产生的抗体能够进一步激活AprA对底物的降解，产生一种全新的抗体依赖的功能增强效应（Antibody-dependent Enhancement，ADE）。为了探究阻断AprA是否能够抑制铜绿假单胞菌对机体的感染，我们进一步通过计算机模建技术分析AprA分子结构，我们设计了一系列的小分子化合物，并进一步筛选获得对AprA活性具有抑制作用的7个小分子抑制剂。另外, 还使用已成药的小分子化合物库, 筛选获得了对AprA活性具有抑制作用的两个小分子化合物, 进一步通过小鼠肺炎模型对其抑制活性进行评价，结果显示Atorvastatin calcium和Temocapril hydrochloride能够显著降低肺炎模型中小鼠肺组织中的细菌沉积。我们的上述研究结果证实AprA蛋白可以通过降解NETs相关组分抑制NETs的杀伤功能，从而介导铜绿假单胞菌的免疫逃逸，其诱导机体产生的抗体通过ADE效应进一步增强AprA酶活性，促进对底物的降解。本课题阐明了AprA对NETs相关组分降解的分子机制，也为抗铜绿假单胞菌感染提供了新的候选药物。