一种与金葡菌天然耐药相关的新的调节性RNA（RNA-V）生物学功能研究

Infection caused by drug-resistant Staphylococcus aureus is difficult to treat. Persister cells, natural drug-tolerant subpopulation, have been identified in several kinds of bacteria. Persistence of this subpopulation is considered to be the self-protection mechanism and the basis for acquisition of resistance genes and recurrence of infetion. In the previous study, we have identified an uncharacterized gene that is significantly related with the percentage of persister cells in S.aureus. In the further investigation, the full length of transcript of this gene has been revealed by 5' and 3' RACE and named as RNA-V. RNA-V contains a coding sequence encoded 55 amino acids, a 5'UTR and a long 3'UTR (162nt). There are few reports about bacterial genes with 3'UTR. Our further study show that the regulation of RNA-V on the percentage of persister cells in S.aureus is dependent on the full length RNA but not the hypothetical protein encoded by RNA-V. Meanwhile, it has been revealed that RNaseIII, which binds to and cleave double-stranded RNA, can specifically bind RNA-V. In this project, we will try to investigate the regulation of RNA-V on its target genes. And the mechanism how RNA-V can regulate the percentage of persister cells in S.aureus will be revealed. Our project will improve the study of natural drug-tolerant subpopulation in S.aureus.

耐药金黄色葡萄球菌引发的感染是临床面临的棘手问题。多种细菌中含有天然耐药亚群persister cells。该亚群的存在是细菌应对抗生素的自我保护机制，是细菌获得耐药基因和引发机体再次感染的基础。已有的研究中，我们鉴定了一种与金葡菌persister cells比例明显相关的功能未知基因。RACE实验结果证实该基因转录本RNA-V全长356nt，包含55个氨基酸的编码区、5'UTR和一个长的3'UTR（162nt）。细菌中带有3'UTR基因的研究报道较少。进一步结果显示RNA-V对persister cells比例的调节依赖于其全长RNA而不是其编码的蛋白质。我们还发现双链RNA酶RNaseIII能够特异结合RNA-V。本项目将在已有的工作基础上，深入研究RNA-V作为一种新的sRNA对靶基因的调控方式，阐明其影响persister cells比例的分子机制，推动金葡菌天然耐药的基础研究。

耐药金黄色葡萄球菌引发的感染是临床面临的棘手问题。我们鉴定了一种与金葡菌耐药明显相关的功能未知基因, 命名为RNA-V。RACE实验结果证实该基因转录本全长356nt，包含55个氨基酸的编码区、5'UTR和一个长的3'UTR（162nt）。进一步结果显示RNA-V对耐药菌比例的调节依赖于其全长RNA而不是其编码的蛋白质。我们进一步通过基因芯片分析获得了野生型与RNA-V突变株之间表达差异的基因；接着我们将抗生素处理后金葡菌变化的基因与RNA-V突变株中变化的基因进行了交叉比对，发现SAOUHSC_02708 (即HlgA)基因在两种芯片中变化趋势明显相反，提示其可能是RNA-V的潜在靶基因。考虑到sRNA通过与靶基因直接互补配对发挥其调节作用，我们利用生物信息学方法对RNA-V和HlgA基因mRNA序列进行了比对，发现RNA-V与HlgA基因翻译起始位点上游核糖体结合区匹配较好，提示其可能通过抑制HlgA基因翻译起始发挥其sRNA调节作用。进一步，我们构建了HlgA-lacZ-pOS1和Mutant-HlgA-lacZ报告载体，并将其电转化入野生型金葡菌8325以及RNA-V突变株，验证了HlgA基因是RNA-V的直接靶基因，随之发现HlgA在RNA-V突变株中的表达水平显著高于野生型。上述实验进一步证实了金葡菌中RNA-V做为sRNA参与了靶基因HlgA的表达调控。另外，我们还证实，在抗生素刺激的应激条件下，RNA-V在金葡菌内的表达水平显著提高，提示其参与了金葡菌的耐药调控过程。针对RNA-V基因可能与金葡菌的天然耐药相关，我们尝试使用不同作用类型的抗生素刺激金葡菌，结果发现只有在靶向作用于细菌细胞壁的抗生素的刺激下金葡菌内RNA-V的表达水平才有显著的提高；同时发现在该类型抗生素的刺激下，金葡菌上清的溶血能力也有显著的提高，且这种溶血能力主要是由β溶血素造成的。通过检测在该类型抗生素的作用下的HlgA 5’UTR-lacZ报告载体的β半乳糖苷酶报告基因活性，进一步证实了在金葡菌中RNA-V作为sRNA负调控HlgA的表达。本研究解析了RNA-V 做为sRNA参与金葡菌毒力调控及耐药过程的机制，在推动金葡菌毒力调控和天然耐药基础研究的同时，也会为临床控制金葡菌感染、降低金葡菌耐药性产生提供潜在的药物靶点。