植物乳杆菌减缓仔猪大肠杆菌性腹泻机制研究

Oral administration of probiotics is an effective method of preventing diarrhea caused by the enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) in children and newborn animals. The underlying mechanism may involve modulations in cell signaling pathways and adjustments in gut barrier function. In a cell model, immunohistochemistry and western blot will be carried out to investigate whether Lactobacillus plantarum adjust and change expression and distribution of tight junction in ETEC infection cells. PCR-array data will also be analyzed to determine transcriptional differences of the genes in NF-κB and MAPK signal pathway in ETEC infected cells. Western blot will also be carried out to detect the trends in expression and phosphorylation of proteins in the signal pathway, and quantitative PCR will be used to determine the changes in cytokine expression and inflammatory response. A following in situ small intestinal segment perfusion model and an ETEC-chanllenged model will also be carried out to determine whether the protein expression in the signal pathway agree with the results of the cell model, further macro genomics and metabolomics analysis will be performed to analyse the intestinal microflora changes and body metabolic characteristics. This research will provide new ideas for the study of mechanism underlying the interaction of Lactobacillus and the host, and provide a theoretical basis for the application of probiotics in prevention and treatment of animal and neonatal diarrhea.

口服益生菌是防治肠毒性大肠杆菌引起的儿童和新生动物腹泻的有效手段，其防治机制可能涉及肠道细胞信号通路和屏障功能的调节。本项目首先通过细胞试验，采用免疫组化、western blot等技术研究植物乳杆菌调节对ETEC感染细胞时紧密连接蛋白的表达和分布变化，采用PCR-array研究植物乳杆菌对ETEC感染细胞时NF-κB和MAPK信号通路中各蛋白转录情况的变化的影响，通过western blot分析信号通路中蛋白的表达量或磷酸化变化趋势，通过荧光定量PCR等技术研究这些变化如何引起细胞因子的表达变化进而缓解细胞的炎性反应；随后通过原位小肠结节灌注的及ETEC感染动物模型验证细胞模型上结果，并通过宏基因组学和代谢组学分析肠道微生物区系变化和机体代谢特征。本研究可为探索研究乳杆菌与机体的互作机制提供新的思路，同时为应用益生菌防治动物及新生儿腹泻提供理论依据。

肠毒性大肠杆菌（enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC）是引起哺乳和断奶仔猪腹泻的主要病原菌之一。多年来，复合抗生素被大量用于ETEC的预防和临床治疗，然而抗生素的使用导致多种耐药性ETEC不断产生并迅速水平传播扩散，不仅造成抗生素疗效降低并在体内沉积，也会导致胃肠道正常菌群的紊乱。因而，口服益生菌替代抗生素的使用成为防治ETEC引起的腹泻的重要手段。针对上述问题，本研究从小鼠试验和仔猪试验出发，探究实验室分离得到的植物乳杆菌对ETEC感染下的肠道微生物的影响，通过高通量测序和代谢组学分析肠道微生物区系变化和机体代谢特征。.通过小鼠试验我们探讨了植物乳杆菌对ETEC造成损伤的保护作用，结果植物乳杆菌能显著缓解ETEC造成的空肠形态学损伤。在植物乳杆菌处理的小鼠中，lysozyme和cryptidin的表达显著降低，而紧密连接蛋白的表达增加。同时植物乳杆菌使ETEC处理的小鼠结肠微生物多样性恢复到正常水平，并增加了Lactobacillus的相对丰度。相比之下，植物乳杆菌降低了ETEC激发后结肠中Proteobacteria、Clostridia、Epsilonproteobacteria和Helicobacter的相对丰度。.仔猪饲喂试验表明植物乳杆菌对ETEC造成的仔猪损伤的保护作用。我们观察到植物乳杆菌能够有效地防止由ETEC引起的空肠的形态学损伤。16s rRNA测序结果表明，植物乳杆菌能够维持肠道微生物群落的结构，增加仔猪肠道微生物多样性，抑制肠道病原体Proteobacteria等的含量。通过血清代谢组学分析，我们发现植物乳杆菌显著提高了亚油酸乙醇酰胺等物质的含量，从而提高了机体的免疫功能。.综上所述，ETEC会抑制仔猪生长、破坏空肠绒毛结构，并造成肠道损伤，而植物乳杆菌能够促进一些有益代谢的产生并抑制一些有害代谢物的产生，并逆转这些损伤情况，恢复仔猪生长、改善肠道组织损伤情况、恢复肠道微生物多样性，这对于减缓仔猪大肠杆菌性腹泻具有重要的意义。