蛋白磷酸酶PP2A调控血小板活化和血栓形成的作用及机制研究

PI3K is an important molecular for maintaining the integrin αIIbβ3 activation condition. Phosphatase PP2A is a platelet endogenous negative regulation of PI3K/Akt signal protein. However, a role for PP2A in platelet signal transduction is not clear. In the preliminary experiment we found that integrin activation and platelet aggregation were significantly reduced for PP2Ac(-/-) platelets, which indicated that PP2A maybe an important molecules involved in platelet activation and thrombosis. Theoretically, PP2A negatively regulates Akt in multiple cellular systems. However, Akt phosphorylation of PP2Ac(-/-) platelet decreased, which implied that PP2A regulates Akt through a novel signaling pathways and the mechanisms that regulate platelet functions remain poorly defined. Combining of approach of knockout mice, blood vessel damage model and molecular biology，we aim to (1) study the effect of PP2A on platelet functions and thrombus formation (2)explore the molecular mechanism of PP2A regulating PI3K/Akt and integrin activation. The current project will reveal the new mechanism of PP2A regulating platelet activation in thrombus formation and will forward the development of a new class of novel anti-thrombus agents and lead to finding the new drug target.

PI3K/Akt信号是诱导并维持血小板表面整合素αIIbβ3的活化状态的一个重要信号。PP2A是细胞内源性负性调控PI3K/Akt信号的重要分子，但PP2A在血小板中信号转导研究甚少。我们前期获取血小板定向敲除PP2Ac小鼠，发现敲除小鼠血小板整合素αIIbβ3活性降低，聚集率降低，提示PP2A可能是参与血小板活化和血栓形成的重要分子。理论上PP2A负性调控Akt，但我们发现PP2Ac-/-血小板Akt磷酸化降低，提示我们血小板中PP2A具有一条新颖的调控Akt的信号通路，但具体机制不明确。本研究将利用PP2Ac-/-小鼠、血管损伤血栓模型和分子生物学技术(1)深入研究PP2A对血小板功能和血栓形成的影响(2)探讨PP2A调控PI3K/Akt信号转导和整合素活化的机制，该项目的实施有助于阐明PP2A调控血小板活化在血栓形成中的作用，为开发新的防治血栓栓塞性疾病的药物提供理论基础和新的靶点。

整合素αIIbβ3（αIIbβ3 integrin）是血小板中特有的、与血小板激活密切相关的膜蛋白。在血小板整合素αIIbβ3的激活，尤其在整合素活化状态的维持中，PI3K/Akt信号通路发挥着重要的作用，蛋白磷酸酶PP2A是一种广泛存在的丝/苏氨酸磷酸酶，是细胞内源性负性调控PI3K/Akt信号的一个关键蛋白。但PP2A在血小板中的功能及其介导的信号转导研究甚少。在本项目中，我们建立的血小板特异性敲除PP2Ac-/-小鼠，采用细胞生物学，分子生物学及免疫印迹和血栓模型等方法进行体内和体外的研究，对PP2A在血小板的功能和血栓形成中的作用和分子机制进行了研究。研究结果表明，PP2Ac缺失严重损伤了血小板的聚集、释放、粘附、扩展和斑块回缩等功能，在体外模拟血栓模型中也发现PP2Ac缺失可减弱血栓形成。同时我们发现，PP2A的缺失影响血小板整合素的“由内向外”和“由外向内”双向信号转导。有趣的是，我们发现PP2Ac缺失后，血小板中Akt的蛋白磷酸化（thr308和ser473位点）均没有升高反而降低。为了深入研究PP2A调控Akt的分子机制，我们检测发现PP2Ac缺失后，对于其他负性调控Akt的SHIP1和PTEN蛋白磷酸化无影响。但在PP2Ac缺失的血小板中，激活Akt上游的P85α，PDK1和mTOR等蛋白的磷酸化均降低。此外，我们发现PP2A的缺失对MAPKs通路的蛋白和Src蛋白磷酸化均有抑制效果。PP2A可通过抑制上游激活Akt的蛋白活性调控Akt达到调控血小板功能的目的。因此，该研究深入揭示了PP2A在血小板中的功能和作用的分子机制，加深了对血栓性疾病的分子病理机制的理解，有助于我们理解血小板活化的分子调控机制，为开发预防和治疗血管栓塞性疾病的药物提供新的靶点。