基于构效关系的乳铁蛋白新抗菌片段发掘、拼接、评价和高效表达

借助于生物信息学工具，模拟LF空间结构和分析表面电荷分布，在LFcin、LFampin之外发掘具有潜在抗菌功能的多肽片段，阐明乳铁蛋白的抗菌机制，揭示乳铁蛋白构效关系，为LF抗菌肽分子设计改造奠定基础；遵循设计的LF抗菌片段分子量在20到40 kDa之间的原则，基于LF抗菌肽和LF一级结构拼接LF高抗菌嵌合体，基于结构域与功能基团设计LF新抗菌片段，通过重组技术结合功能评价筛选3-5条高效高产LF新抗菌片段；通过构建同时含有细菌血红蛋白基因（Vgb）表达盒和高效高产LF新抗菌片段基因多拷贝表达盒载体，建立基于改善毕赤酵母代谢工程的高效高产LF新抗菌片段多拷贝表达盒高效表达体系，获得安全、环保、高产、高效的基因工程新型抗菌蛋白高效高产LF新抗菌片段，最终推进新型抗菌蛋白的工业化应用。

按照合同任务书要求，完成全部任务。主要研究成果如下：设计了包含N-叶（1-333）和两叶连接区域的α-螺旋（334-344）牛乳铁蛋白衍生抗菌片段BLfA，以另一衍生抗菌片段BLfB（1-284）以及牛乳铁蛋白N-叶BLfN（1-333）和全长分子BLf（1-689）为对照组，通过分子设计确立的BLfA、BLfB、BLfN和BLf进行三维结构模拟和物理化学参数计算及对比，结果显示BLfA基本保持了其在天然牛乳铁蛋白中的原有结构，并具有4个分子中最强的分子表面阳离子特性。从荷斯坦奶牛乳腺组织中克隆了BLfA、BLfB、BLfN和BLf的编码基因，分别构建了大肠杆菌和毕赤酵母重组表达菌株。BLfA、BLfB和BLf在大肠杆菌BL21(DE3)中以包涵体形式表达，在毕赤酵母摇瓶水平得到分泌表达。利用透明颤菌血红蛋白VHb在宿主菌胞内与rBLfA共表达，使rBLfA发酵罐水平的表达量提高至613 mg/L。.rBLfA释放Fe3+的pH范围(pH 7.0-3.5)变宽，表明非刚性与刚性的BLf连接区结构可能均起到稳定N-叶铁离子结合结构的作用。rBLfA抑Staphylococcus aureus生长活性增强可能由BLf连接区域的强阳离子分子表面特性所致。其作用机制可能是富含正电荷的连接区域α-螺旋与S. aureus细胞表面带负电荷的分子结合，引起细胞裂解，从而起到抑菌和杀菌的作用。.同时，开展了昆明种小白鼠乳铁蛋白和密码子优化改造的牛乳铁蛋白在大肠杆菌和毕赤酵母中的异源表达、纯化和生物学功能鉴定工作。.合同书任务之外，还开展了基于乳铁蛋白肽的杂合肽LHP（选取LH28和plectasin为母体肽，以柔性氨基酸(GGGGS)3为接头）的研究，实现其在毕赤酵母中的表达，其抗菌活性优于其母体肽，其对于Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae 和 Streptococcus suis的MIC值分别为0.091，0.023 和 0.18 μM，另外LHP针对临床耐药性金黄色葡萄球菌的抗菌活性(MICs= 0.73-2.91 μM)优于plectasin。与氨苄、庆大霉素、利福平和四环素协同作用，FIC值为0.375-1.0。测定了LHP的pH稳定性、热稳定性、溶血性和蛋白酶稳定性。