饲用胞内杀菌肽（抗体靶向肽、入胞抗菌肽）：构建及靶细胞特异性和可及性机制

The bactericidal properties and mechanisms of antibody-peptide-conjugate (APC) and CPP-peptide-conjugate (CPC) against intracellular pathogen such as Salmonella enterica and Staphylococcus aureus in livestock and poultry will be focused on the following three aspects: 1) design of a novel antibody peptide APC targeting intracellular S. enterica with low tocixity and high specificity, and evalution of its stability and bactericidal function in vivo; 2) elucidation of the antibacterial activity, pharmacokinetics characteristics, and internalization mechanism of bLfcin6 modified peptide CPC targeting intracellular S. aureus in vitro and in vivo; 3) APC and CPC are characterized by targeting, high specificity, good delivery efficiency, and enhancing antibacetial activity against S. enterica and S. aureus. This provides a new idea for the design and development molecular targeted antimicrobial peptides against intracellular pathogens in livestock and poultry.

在本小组畜禽用抗菌肽持续研究积累的材料方法基础上，采用分子设计等药物生物技术引入靶向、入胞元件构建专杀畜禽胞内病原菌的抗体靶向肽（APC）和入胞抗菌肽（CPC），研究揭示APC和CPC杀灭胞内菌的过程、效果、分子与细胞学机制。研究内容：1）设计构建并优选高效、低毒、特异性强的新型APC制剂，探索其对畜禽胞内沙门氏菌靶向精准杀灭的效果与机制；2）设计构建并筛选安全传递、高效入胞的CPC制剂，研究明确CPC高效转运、入胞杀灭畜禽胞内金黄色葡萄球菌的效果和机制；3）通过特定引入元件和抗菌肽共价构建，表征APC和CPC在模式细胞和动物中靶向、递送、释放、杀菌的机制，建立新产品杀灭胞内菌的体内体外构效和量效关系。通过突破抗菌肽临床应用的技术瓶颈和结构缺陷，创立畜禽专用胞内杀菌肽构建新方法，揭示新产品专杀胞内菌的分子与细胞学机制，创制重点新产品，为畜禽病原菌尤其是胞内菌的防治提供方法、技术和产品支持。

针对在畜禽病原菌的胞内感染、耐药性控制中抗生素 “特异性不强”和“低效转运入胞”两大瓶颈问题，完成以下研究工作：.（1）CPPs-N2嵌合肽的创制及其胞内杀菌：将N2与细胞穿膜肽CPP（源自HIV-1反式激活因子的Tat11及牛乳铁蛋白的bLFcin6）偶联，获得嵌合肽B6N2和T11N2，可通过能量依赖的巨胞饮及网格蛋白介导的内吞作用入胞，内化率达28.3%和93.5%，50μM的B6N2和T11N2的胞内菌清除率比等浓度N2提高85.3%和99.6%。.（2）T11-Linker-N6嵌合肽（CNC）及N6NH2的创制及其胞内杀菌：将N6与Tat11通过组织蛋白酶敏感性连接子进行连接，获得CNC；将N6进行C端酰胺化提高其酸耐受性。二者在体外杀胞内沙门氏菌活性分别比N6高67.2-76.2% 和96.3-97.6%；1-2 μmol/kg的CNC和N6NH2对致死剂量沙门氏菌攻毒小鼠的治愈率分别达66.7-100%，优于N6（33.4-66.7%）。.（3）抗菌肽NZ2114、MP1102及H2对专职/非专职吞噬细胞（RAW264.7/牛乳腺上皮细胞MAC-T）胞内金葡菌感染治疗效果及机理探索：肽可通过胞吞及巨胞饮作用进入细胞，定位于细胞质，胞内积累量具浓度依赖性。NZ2114及H2对MAC-T内MRSA ATCC 43300及临床分离株E48抑菌率达99%及94%，优于万古霉素（20%）。小鼠腹膜炎模型结果表明，NZ2114及MP1102对胞内MSSA ATCC 25923及ATCC 43300杀菌效果优于或与万古霉素一致。NZ2114及H2小鼠乳腺炎治疗效果（降低3.96 及 3.58个数量级）优于万古霉素（1.59）。.（4）CPP-NZ2114的分子设计、异源表达与活性测定： LFcin6以脯氨酸或GGGGS柔性接头偶连NZ2114，构建重组载体，转化毕赤酵母，获得LFcin6-P-NZ2114和LFcin6-GGGGS-NZ2114活性产物。相对母体肽，其抗菌活性大幅度降低，毒性下降，酸性环境稳定性提高，胞内MSSA ATCC 25923杀菌率达68%-84%以上。.本项目突破抗菌肽临床应用的技术瓶颈和结构缺陷，创立畜禽专用胞内杀菌肽构建新方法，揭示新产品入胞及胞内杀菌机制，为畜禽病原菌尤其是胞内菌的防治提供方法、技术和产品支持。