青蒿素及其衍生物抗囊型包虫病药效作用及氧化损伤机制的研究

Cystic echinococcosis is the high incidence of zoonotic diseases in Xinjiang and other seven provinces (area). It is accounting for 95% of the hydatid cases which pathogens is Echinococcus granulosus. According to the published literature, the peroxide bridge of artemisinin and its its derivatives catalyzed by Fe2+ to generate superoxide free radical that damage DNA, protein and other macromolecules, resulting in the parasite death, such as Plasmodium. We found artemisinin had great effect on the vitality and ultrastructure of Echinococcus granulosus, and the superoxide free radical content and expression quantity of the gene related to DNA damage repair were increased. But its mechanism of action is unkonow. Therefor, we propose the scientific hypothesis that artemisinin damage the DNA of Echinococcus granulosus result in dead by superoxide free radical. This study will via in vivo and in vitro research, using transmission electron microscopy, DNA damage detection, gene chip, RNA interference, RT-qPCR and in situ hybridization, from the morphology, cell, protein and gene expression level, to test hypothesis. This study will lay the theoretical foundation for the elucidation of artemisinin and its derivatives against cystic hydatid disease mechanism and development of new drugs for the treatment of hydatid disease.

囊型包虫病是新疆等七省（区）高发的人畜共患病，占我国包虫病例的95%，其病原生物为细粒棘球蚴。据文献报道，青蒿素及其衍生物的过氧桥键经Fe2+催化产生超氧自由基，破坏DNA、蛋白等大分子物质，致使疟原虫等寄生虫死亡。我们实验发现青蒿素对细粒棘球蚴的活性、超微结构均有较大影响，及经其干预后虫体内超氧自由基含量和DNA损伤修复相关的基因表达量均增多，但其作用机制未知。因此，我们提出“青蒿素经超氧自由基致细粒棘球蚴DNA损伤，影响虫体活性”的科学假说，拟通过克隆细粒棘球蚴DNA损伤修复相关基因及鉴定功能，体外培养及体外动物模型，采用青蒿素及其衍生物、ROS清除剂及DNA损伤修复剂干预，应用透射电镜，DNA损伤检测，基因芯片，RNA干扰及RT-qPCR等技术，从形态，细胞，蛋白及基因表达等层面，验证假说。此研究将为阐明青蒿素及其衍生物抗囊型包虫病的作用机制和研发新型治疗包虫病药物奠定基础。

本课题在已建立的药效学筛选平台上，对青蒿素、双氢青蒿素、青蒿琥酯和蒿甲醚体内/体外抗囊型包虫病药效学作用进行综合评价，证实青蒿素类药物在体内体外均具有抗囊型包虫的作用，其中双氢青蒿素作用最佳。并且，采用甘露醇作为活性氧清除剂进行DNA氧化损伤相关指标的检测，初步证实青蒿素类药物抗囊型包虫病作用机制为产生ROS导致其虫体死亡。. 在证实青蒿素通过产生ROS可导致其虫体死亡的基础之上，检测DNA损伤修复抑制剂维利帕尼（Veliparib）联合青蒿素及其衍生物（双氢青蒿素，青蒿琥酯和蒿甲醚）抗囊型包虫病药效作用。结合上述两部分实验初步揭示了青蒿素类药物抗囊型包虫病作用机制可能是产生ROS诱导氧化DNA损伤，从而发挥抗囊型包虫病的作用，本研究为青蒿素类药物抗包虫病新药的开发和作用靶点的筛选奠定了理论基础。. 应用基因芯片技术筛选青蒿素干预后细粒棘球蚴差异表达基因，发现与DNA氧化损伤修复相关基因EgRPS9、EgRad9和EgTPx的表达量上调。本研究克隆EgRPS9、EgRad9和EgTPx全长基因，分别构建其克隆载体和表达载体，通过PCR、双酶切及测序技术进行鉴定。并且，采用电穿孔法分别将EgRPS9-siRNA、EgRad9-siRNA和EgTPx-siRNA的三条干扰序列转染细粒棘球蚴，构建DNA氧化损伤阳性模型，根据活性检测及qRT-PCR结果从中筛选各基因干扰效果较好的siRNA干扰序列。用筛选所得的siRNA转染细粒棘球蚴，联合细粒棘球蚴体外耐受H2O2的最大浓度干预，采用单细胞凝胶电泳和ROS含量检测干扰前后细粒棘球蚴DNA损伤程度及体内ROS含量的变化。筛选所得的各基因siRNA干扰序列转染细粒棘球蚴，协同细粒棘球蚴体外耐受青蒿素的最大浓度干预，通过活性检测、超微结构观察、基因表达水平检测、蛋白表达水平检测及DNA氧化损伤指标检测，综合分析各基因在青蒿素致细粒棘球蚴DNA氧化损伤过程中的功能作用。结果显示EgRPS9、EgRad9和EgTPx基因可以修复青蒿素通过产生ROS对细粒棘球蚴造成的DNA氧化损伤，干扰EgRPS9、EgRad9和EgTPx基因的表达，能增强青蒿素抗细粒棘球蚴的药效。此部分研究从基因层面同样证实DNA氧化损伤是青蒿素抗细粒棘球蚴的作用机制之一。