基于硫醌氧化还原酶表达的微生物传感器构建及其对环境污染物硫化物检测研究

Environmental pollution caused by sulfide has become a major issue for human survival and health. However, there is no efficient detection method towards sulfide for environment detection. Sulfide:quinone oxidoreductase, as a key enzyme in the sulfide metabolism in microbial cells, has specific catalytic oxidation of sulfide. Moreover, the cloning and expression of sulfide:quinone oxidoreductase in Escherichia coli BL21 has been completed in our previous work. In this project, further study will be carried out to explore the construction of a microbial biosensor and its direct electrochemical catalysis towards sulfide according to the specific oxidation catalyzed by sulfide:quinone oxidoreductase. First, nanoporous gold with unique physical and chemical properties is selected for E. coli BL21 immobilization and microbial biosensor construction. Second, the electrochemical behavior and interfacial electrochemical reaction mechanism of E. coli BL21 on electrode surface will be explored. Third, the electrochemical performance of the microbial biosensor will be evaluated, and the optimal working and regeneration condition will be confirmed. Additionally, the detection range of microbial biosensor will be determined along with detection limit and sensitivity. Fourth, the practical performance of the microbial biosensor will be evaluated by detecting sulfide in water environment and blood. Besides, the anti-interference ability, stability, and reproducibility of the microbial biosensor will be measured, respectively. This project will establish an efficient direct electrochemical detection method towards sulfide. It will provide a theoretical and technical foundation for the environmental pollution control caused by sulfide, the mechanism of biological oxidation of sulfide, and the research on endogenous sulfides as diagnostic indicator.

恶臭污染物硫化物引起的环境污染已成为影响人类生存与健康的重大问题。基于目前硫化物有效检测方法缺失及对微生物硫化物代谢中关键酶的研究，本项目拟在硫醌氧化还原酶对硫化物特异催化氧化及前期硫醌氧化还原酶克隆表达研究基础上，深入开展基于硫醌氧化还原酶表达的大肠杆菌全细胞传感器构建及其对硫化物检测研究。选择具有独特理化性能的纳米多孔金作为固定化载体，构建基于硫醌氧化还原酶表达的大肠杆菌全细胞传感器；探索大肠杆菌细胞在电极表面的电化学行为及界面电化学反应机理；进行传感器对硫化物的电催化及电化学响应分析，确定检测范围、检测限、灵敏度及再生条件；在此基础上，考察水环境和血液中硫化物的电化学响应，并对传感器的抗干扰能力、重复利用及稳定性进行评价。该申请项目研究将建立硫化物直接电化学检测技术，为硫化物污染环境治理、硫化物生物氧化机理研究和内源性硫化物作为临床诊断指标的相关研究提供一定理论和技术基础。

本项目旨在将硫醌氧化还原酶（SQR）和纳米多孔金（NPG）的共催化作用与还原氧化石墨烯（rGO）的优异导电能力相结合建立硫化物的电化学检测技术。. 首先利用能够异源表达SQR的重组E. coli BL21SQR细胞作为识别元件，以具有高生物相容性并且对硫化物具有催化活性的NPG为固定化载体，制备了E. coli BL21SQR/NPG/GCE电极。电化学检测表明，Na2S在E. coli BL21SQR/NPG/GCE电极表面发生的氧化还原反应是SQR与NPG共同催化的结果，且该反应是一个不可逆的扩散控制过程。E. coli BL21SQR/NPG/GCE电极对Na2S具有较宽的线性响应范围（50 μM~5 mM），检测灵敏度为18.35 μA mM−1 cm−2、检测限低至2.55 μM。抗干扰实验表明，该电极对污水中可能存在的部分阳离子、阴离子、有机污染物、尤其是剧毒的氰化物（CN−）均表现出良好的抗干扰能力。利用所构建电极实现了污水中硫化物的快速定量检测，成功建立了硫化物的DPV电化学检测方法。. 为了进一步提高微生物传感器对硫化物检测的灵敏性，实现对低浓度硫化物的检测，本项目提出了一种将重组E. coli BL21SQR细胞和NPG的共催化作用与rGO的优异导电能力协同作用的新策略。首先制备了rGO/NPG复合材料，并将其作为识别元件重组E. coli BL21SQR细胞的固定化载体，成功构建了E. coli BL21SQR/rGO/NPG/GCE电极。在E. coli BL21SQR细胞、NPG和rGO三者的协同作用下，利用i-t方法进行检测，E. coli BL21SQR/rGO/NPG/GCE电极对低浓度硫化物表现出良好的检测性能，检测灵敏度达到400.42 μA mM−1 cm−2，线性响应范围为100 nM~7 mM，检测限低至98.5 nM。此外，该电极成功地应用于污水中低浓度硫化物的检测，并表现出良好的抗干扰性能、重现性和稳定性。这些结果说明E. coli BL21SQR/rGO/NPG/GCE电极可以为低浓度硫化物的检测提供一种可靠、灵敏的i-t电化学检测方法。. 本项目所建立的硫化物电化学检测方法具有较强的实用性和应用开发前景，可以为硫化物污染治理、硫化物生物氧化机理研究及内源性硫化物临床诊断提供可靠的检测技术支撑。