单环刺螠硫化物氧化代谢的分子特征及硫醌氧化还原酶基因的转录调控

硫化物是近岸和养殖池塘中常见的有害物质，沿岸经济动物单环刺螠体内存在硫化物氧化解毒过程。本项目将在前期对单环刺螠硫醌氧化还原酶（SQR）研究的基础上，采用基因组步移法克隆SQR基因的启动子并进行功能分析；凝胶迁移和染色质免疫共沉淀技术获得与该启动子结合的转录因子并对其进行鉴定；ELISA分析硫化物暴露下转录因子的蛋白表达并对比sqr mRNA表达特点，验证转录因子功能；荧光定量PCR和Westernbloting检测由RNAi抑制转录因子基因后，该转录因子基因和SQR基因的表达，确定转录因子的功能；克隆硫化物氧化过程中另外两个关键酶硫双加氧酶和硫转移酶的全长cDNA，给出其在mRNA、蛋白质和酶活性水平下与硫化物之间的动力学参数，确定其酶学特性和在单环刺螠硫化物氧化代谢中的作用。本项目将揭示刺螠动物线粒体硫化物氧化解毒的分子机制，有望在线粒体硫化物代谢关键基因的转录调控方面取得创新性成果。

单环刺螠是我国黄渤海唯一分布的无管螠目经济动物，能够耐受和代谢环境硫化物，具有潜在地改良沿岸和养殖池塘底质质量的应用前景。本项目我们克隆获得了单环刺螠sqr（硫醌氧化还原酶基因）基因组编码区序列，其全长为7.3 kb，包含11个外显子和10个内含子；采用基因组步移获得了长为2.6 kb的sqr上游侧翼区序列；构建了含有不同区段上游侧翼区和引导区序列的EGFP质粒，将其转染293FT细胞，确定sqr上游序列的-391~+194区段，尤其是+1~+194区段为该基因转录调控的关键序列。采用生物信息学分析、酵母单杂交技术、染色质免疫共沉淀等技术，确定YY1、TFIID、HSF1、NF1、SP8等为结合在sqr关键序列的重要转录因子。克隆了单环刺螠硫双加氧酶（SDO）和硫转移酶的全长cDNA，采用定量RT-PCR和ELISA技术检测了线粒体硫化物氧化解毒关键酶在单环刺螠硫化物暴露期间主要组织的表达动力学特征；采用体外分段表达和定点突变技术，确定了单环刺螠SDO酶活催化中心和辅助因子结合位点；结合酶学分析，初步确定单环刺螠消化道尤其是呼吸肠是硫化物氧化解毒的关键部位，体壁和肛门囊可能通过改变酶的构象（如SDO）或者增加辅助因子如GSH浓度实现有机体对硫化物的适应。此外本项目利用illumina测序技术，完成了单环刺螠转录组和硫化物应激前后单环刺螠组织的基因差异表达谱分析，获得52093个unigene，其中9447个unigene涉及了25个生物学过程，337个unigene与生长相关，645个unigene与生殖有关，3013个unigene与胁迫有关，18884个unigene参与了254个通路的调控；确定上调表达基因976个，下调表达基因731个，6777个差异基因涉及224个信号通路。上述成果为更好地认识单环刺螠的硫化物代谢分子特征以及探究真核生物硫代谢机制提供重要的分子证据。