多能硫碱弧菌D301异二硫化物还原酶（hdrABC）途径的单质硫氧化机理及其调控机制研究

The oxidization of elemental sulfur is a key restraining factors on economical efficiency of biological desulfurization process containing H2S gas. However, few studies have sufficient information on oxidization pathway of elemental sulfur of biodesulfurizing bacteria and its regulation mechanism. Thioalkalivibrio versutus D301 with haloalkaliphilic physiological characteristics is an efficient biodesulfurizing strain selected by our group, which has broad application prospects in biodesulfurzation industry. In this project, we will study an key enzyme heterodesulfide reductase (Hdr) of elemental sulfur oxidization pathway of D301 strain to reveal oxidization mechanism of elemental sulfur and relative regulation mechanism. Some biochemical and molecular biological methods, like spectrum analysis, site-directed mutagenesis, co-immunoprecipitation, and so on, were conducted to analyze protein structure, which will help reveal some properties of functional domain. The phylogenetic analysis will be performed to reveal variation pattern of functional domain and find some key amino acid sites related to catalysis action. Some hdr mutant strain need to be constructed, then metabolic difference of elemental sulfur oxidization pathway between wild type and mutant strains will be studied. Furthermore, based on the results of protein structure and phylogenetic analysis, the function of Hdr will be proposed. Finally, the effect of Hdr on this oxidization pathway and relevant regulation mechanism will be revealed. The project has an important scientific significance to perfect the research of elemental sulfur oxidization metabolism of desulfurizing bacteria, and supplies some theoretical foundation for directional transformation of the strains.

单质硫氧化是制约含H2S气体的生物脱硫工艺经济性关键因素。然而，脱硫细菌中有关单质硫氧化途径及其调控机制的研究却很少。多能硫碱弧菌D301是本实验室分离的一株高效的脱硫菌，具有嗜盐嗜碱特性，在生物脱硫领域应用前景广阔。本项目拟通过研究多能硫碱弧单质硫氧化途径的关键酶Hdr，揭示该途径的单质硫氧化机理及其调控机制。通过光谱分析、定点突变、免疫共沉淀等技术解析Hdr蛋白结构，揭示功能结构域特征；通过系统发育分析揭示Hdr蛋白功能结构域的变异规律和催化相关的关键氨基酸位点；构建hdr基因缺陷型菌株，通过转录组、RT-PCR等技术研究野生菌与突变菌单质硫氧化代谢的差异，并结合蛋白结构和系统发育分析的结果提出Hdr的作用机理，揭示Hdr对单质硫氧化途径的影响及细胞调控单质硫氧化的机制。本项目对完善脱硫菌株的单质硫氧化代谢的研究有重要的科学意义，也为脱硫菌株的定向改造提供理论依据。

单质硫氧化是制约含H2S气体的生物脱硫工艺经济性关键因素。然而，脱硫细菌中有关单质硫氧化途径及其调控机制的研究却很少。多能硫碱弧菌D301是本实验室分离的一株高效的脱硫菌，具有嗜盐嗜碱特性，在生物脱硫领域应用前景广阔。本项目针对多能硫碱弧单质硫氧化途径的关键酶Hdr开展研究，揭示该途径的单质硫氧化机理及其调控机制。首先，通过筛选高活性启动子和和终止子，并基于构建了基于铁诱导系统的严谨型基因表达系统，实现了外源基因在D301菌株内的可控诱导表达；进一步，基于CRISPR-Cas9系统，通过元件优化工程，形成针对硫碱弧菌的高效单质粒基因编辑工具，单基因编辑效率最高达到58%，并以此开展对hdrABC及相关基因功能的研究。而单质硫氧化酶 HdrABC 和SdoA 被敲除后， 细胞 OD600 值分别提高了 62.1%和 35.1%。硫碱弧菌的单质硫转运蛋白 Rhd 和 TusA 被敲除后，细胞生长 OD600 值分别提高了 38.3%和 32.8%。HdrABC 的缺失诱导细胞单质硫产量提高了 5%，表明 HdrABC 是硫碱弧菌单质硫氧化的关键蛋白。此外，本项目还开展硫碱弧菌硫代谢网络的深入解析，结合基因操作工具验证基因功能的方法，完善了原有硫代谢网络图。最后，为推进D301的菌株的工程应用，本项目开发出了基于补料-批式培养的硫碱弧菌高效的培养策略，实现了细胞密度以及单质硫产量的双提升，进一步，本项目成功开出发高效的嗜盐嗜碱生物脱硫工艺，获得最优的工艺操作条件，单质硫选择生成率达到86%。硫化氢的脱除率达到100%；通过将该工艺与含硫废水结合，形成了嗜盐嗜碱硫酸盐深度处理及硫回收工艺，扩展了D301菌株的使用场景。总之，在本项目的支持下，我们开出了高效的分子操作工具，进而对hdr基因簇进行了深入的研究，揭示了hdr基因簇对在硫碱弧菌硫代谢过程中的关键作用，为进一步的高效工程菌株构建奠定基础；此外，开展多项基于D301菌株的工艺开发，以期尽早实现其工业应用。