硫碱弧菌(Thialkalivibrio sp.)D301硫醌氧化还原酶表达调控机制与进化研究

Sulfide is a widely distributed poisonous gas. Sulfide:quinone oxidoreductase (SQR) is the key enzyme for the oxidation of sulfide to elemental sulfur in microorganisms and animals. In this research, the evolution and regulatory mechanism of the expression of SQR from Thialkalivibrio sp. D301, a novel haloalkaliphilic chemolithoautotrophic sulfide oxidizing bacteria separated from soda lakes in Inner Mongolia, will be studied. The promoter, functional gene and regulatory sequences for SQR will be identified via genome analysis and comparative proteomics. Biochemical and molecular biological methods, like degerate PCR, Tail-PCR, gene knockout/complementation method, fusion expression with reporter gene, real-time PCR, genome walking, promoter deletion, site-directed mutagenesis, will be adopted to explore the function of promoter, signal peptide and regulatory sequence. The transcriptional regulation mechanism of SQR will be investigated. Expression of SQR under different conditions will be analyzed. The enzymatic characteristics of SQR will be studied with purified SQR enzymes. Bioinformatics studies of SQR and regulatory sequence will be conducted to forecast the evolution of SQR in bacteria, archaea and animals (including human being). This research will be helpful to reveal the evolution and regulatory mechanism of the expression of SQR from Thialkalivibrio sp. D301. It will also provide technical support for the bioremediation of sulfide containing gases, like natural gas, biogas and landfill gas.

硫化氢是一种广泛分布的有毒气体，硫醌氧化还原酶（SQR）是微生物和动物代谢硫化氢的关键酶。本项目拟针对实验室分离的一株高效硫化物代谢化能自养菌- - 硫碱弧菌(Thialkalivibrio sp.)D301，开展SQR表达调控机制与进化的研究。利用生物信息学方法从硫碱弧菌基因组中寻找SQR基因序列，与蛋白质组学方法结合，确定硫碱弧菌SQR相关基因及其表达调控区域；利用兼并引物PCR、Tail-PCR、基因敲除/互补方法、报告基因融合表达、实时定量PCR、染色体步移、启动子缺失、定点突变等技术，研究不同条件下SQR基因转录和翻译情况，确定其调控序列、启动子序列、SQR酶编码区、信号肽、SQR在细胞中的定位等，并解析其酶学性质。通过项目的开展，将阐明硫碱弧菌SQR表达调控和进化机制，为自养和异养微生物及动物硫代谢研究提供借鉴，并将有助于天然气和沼气的生物脱硫过程强化。

硫化氢（H2S）是一种无色、剧毒气体，极易对设备、管路、电子元件等造成腐蚀。微生物可以高效地将 H2S 转化为单质硫。与传统的物理、化学方法相比，生物脱硫法具有能耗低、条件温和、无二次污染、设备简单等优点。硫醌氧化还原酶是微生物和动物代谢硫化氢的关键酶。本项目拟针对实验室分离的一株高效硫化物代谢化能自养菌——硫碱弧菌D301开展相关的研究。首先，对D301进行了全基因组测序，结果表明，D301基因组大小为2.96 M，G+C%达到66.03 %，编码基因2,672个。进行了生理生化分析，发现D301菌株的呼吸醌类型主要为泛醌Ubiquinone-10。其次，通过紫外诱变获得高生长活性和脱硫活性的 D301的突变型菌株 SOB306。利用接合转移法建立了适合硫碱弧菌的高效的遗传转化系统，将广宿主带有链霉素抗性的质粒转入细胞。筛选到高强度的tac和p3启动并使rfp、gfp等报告基因在胞内表达在SOB306中得到高效的表达。基于自杀质粒介导的基因敲除方法，进行了基因敲除实验，成功敲除了SOB306菌株的编码甲基化酶 hsdM 基因。第三，制备了磁性纳米颗粒，实现脱硫细胞的固定化，发现固定化细胞于游离细胞硫氧化速率几乎相同，且固定化细胞可以多次重复利用。最后，利用硫碱弧菌SOB306在75 L的生物硫氧化系统中进行了的H2S吸收及脱除的实验，实现快速启动反应器的操作方法，通过控制ORP在在-395 mV下，SO42-生成率低于9%，单质硫的生成速率达到2.82 kg/m3·d。在此基础上，研发了103m级的中试脱硫系统，中试装置的沼气负荷可以达到1,000 m3/d 以上，可使沼气中H2S 的含量从14,000 ppm降低到 20 ppm以下。硫磺产率超过6 kg/m3·d，而且大部分硫颗粒在2分钟内几乎可以完全沉降下来。通过项目的支持，开展了对硫碱弧菌分子层面的研究，开发了分子工具，为硫醌氧化还原酶的研究提供了途径和手段，为自养和异养微生物及动物硫代谢研究提供借鉴，建立了生物脱硫工艺，为生物脱硫在天然气和沼气应用奠定基础。