NF-κB和Akt信号通路共同调控化疗药物耐受性的分子机理研究

本项目旨在找到NF-κB和Akt这两条细胞内最重要的存活信号通路"共同"调控化疗药物耐受的下游关键分子机理，为以这两条信号通路下游关键分子为靶向的肿瘤治疗策略提供靶点。我们前期研究发现，同时阻断NF-κB和Akt信号传导通路可"协同性地"增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，而同时阻断这两条信号通路"协同性"下调部分组蛋白亚型的表达。基于这些发现，本研究利用稳定表达相应shRNA、NF-κB或Akt信号通路被分别或同时阻断肿瘤细胞株为研究对象，通过体内和体外实验，研究NF-κB和Akt信号通路对组蛋白亚型的调控作用及相应组蛋白表达水平对化疗药物耐受的影响，重点探讨组蛋白介导的肿瘤细胞耐药分子机理。本研究预期成果，不仅将拓展细胞存活信号通路和组蛋白基因表达在调控化疗药物反应性机理研究领域的空间，也将为克服肿瘤耐药这一难题、开拓以NF-κB和Akt下游关键分子为靶向的肿瘤治疗新策略提供依据。

NF-κB和Akt是细胞内两条重要的存活信号通路，在调控化疗药物对肿瘤细胞的敏感性中发挥重要作用。基于前期研究发现同时阻断这两条信号通路“协同性”下调部分组蛋白亚型的表达，本项目研究不同组蛋白亚型表达水平对化疗药物耐受的影响，并探讨其相关分子机理。首先以cDNA array实验中发现的、NF-κB和Akt同时被阻断的人肺癌A549细胞中显著下调的6种组蛋白亚型为研究对象，采用相应siRNA分别抑制它们的表达，发现抑制组蛋白H4表达显著增强A549细胞对顺铂、丝裂霉素C和氮芥的敏感性。在此基础上我们建立了两个稳定表达shRNA、组蛋白H4表达显著被抑制的A549细胞克隆（H4 KD1#和H4KD2#），证实其对顺铂、丝裂霉素C和氮芥的敏感性确实显著增加，且敏感性的增加是通过细胞凋亡通路活化的增加来实现的。我们在另一株人肺癌细胞株H1975和人宫颈癌细胞株HeLa中也证实了该结果，排除了细胞株特异性可能造成的偏差。进一步研究上游机制，证实在NF-κB和Akt同时被阻断的人肺癌A549细胞中H4的表达被下调。对下游机制的研究发现，在两个A549-H4-KD细胞克隆中，顺铂诱导的细胞内活性氧的聚集增加、DNA损伤后修复能力降低，而且能显著下调RIP1、cIAP1、XIAP的蛋白水平，而能抑制活性氧产生的BHA和NAC可显著降低A549-H4-KD对顺铂的敏感性，最重要的是在A549-H4-KD细胞中BHA和NAC可恢复顺铂诱导的cIAP1、XIAP蛋白的下调，但对RIP1分子的下调没有影响，提示当H4蛋白的水平被抑制时，顺铂可诱导细胞内RIP1蛋白下调，导致顺铂诱导的细胞内活性氧聚集显著增加，然后通过下调cIAP1、XIAP蛋白表达从而增加对顺铂的敏感性。然后我们以对照组A549细胞和A549-H4-KD细胞为研究对象，接种裸鼠，发现接种A549-H4-KD细胞的裸鼠对顺铂的敏感性显著高于接种对照组细胞的裸鼠，提示抑制组蛋白H4蛋白的表达可增强顺铂的体内抗肿瘤作用。该研究明确了NF-κB和Akt下游可共同调控组蛋白H4亚型的表达，通过影响DNA损伤修复通路、细胞内活性氧聚集，并涉及RIP1、 cIAP1、XIAP分子的下调，从而增强肿瘤细胞对顺铂等的敏感性。这为从细胞信号通路和组蛋白的角度寻找肿瘤治疗策略提供了新思路。