水稻miR398b在稻瘟病抗性中的作用机理研究

Rice blast is the most devastating disease for rice production caused by fungus Magnaporthe oryzae. MiRNAs are involved in regulating diverse biological processes. However, how do miRNAs regulate rice immunity against blast disease is still unknown. Our previous study revealed that the accumulation of OsmiR398b was increased significantly upon blast fungal infection in both susceptible and resistant rice accessions. The expression of defense-related genes was enhanced greatly, whereas the fungal conidial germination and invasive hypha growth were greatly delayed and suppressed on miR398b-overexpressing transgenic plants. These results demonstrate that miR398b positively regulate rice resistance against blast disease. However, the mechanism of miR398b elevating rice immunity is unknown. In this study, we proposed to test the resistant spectrum of miR398b overexpressing lines and evaluate the resistant responses, including subcellular responses to the blast fungal invasion, H2O2 accumulation and expression of defense-related genes.By high-through transcriptional sequencing and bioinformation analysis, the miR398b-regulated resistant signaling pathway will be figured and related regulating genes will be picked out. Furthermore, we plan to construct the target gene-overexpressing or -silencing transgenic rice lines,and identify the functional target by evaluating resistant responses. This project will significantly help us to learn about the mechanism of rice immunity against blast disease, and contribute to applying the resistance in breeding programs.

稻瘟病是水稻最重要的真菌病害之一，通常稻瘟病抗性研究集中在筛选、鉴定、克隆抗病基因上。miRNA通过调控靶基因参与多种生命活动，但尚不清楚miRNA是如何调控稻瘟病抗性的。我们的前期研究发现miR398b正向调控稻瘟病抗性，过表达miR398b的转基因水稻可明显延迟并减弱稻瘟病菌的侵染，显著提高抗病性。本项目拟在此基础上，通过抗谱测定、抗病细胞学分析、超氧化物迸发、防御相关基因的表达几个方面来剖析过表达miR398b转基因水稻对稻瘟病的抗性；然后通过差异转录组分析绘制miR398b调控稻瘟病抗性的信号通路，找出部分关键调控因子；同时，构建靶基因的过表达和沉默突变体材料，对这些转基因材料进行抗性反应分析及靶基因蛋白的生化功能分析。通过上述三方面的研究，明确miR398b调控稻瘟病抗性的机制，为构筑稻瘟病广谱抗性和水稻抗稻瘟病育种提供有力的理论依据。

项目背景：稻瘟病是水稻最重要的真菌病害之一，我们的前期研究发现miR398b正向调控稻瘟病抗性，过表达miR398b的转基因水稻（OX398b）可明显延迟并减弱稻瘟病菌的侵染，显著提高抗病性，但尚不清楚miR398是如何参与调控稻瘟病抗性。..主要研究内容：本项目在此基础上，构建了靶标诱导序列（target mimicry）的过表达材料MIM398，4个靶基因[Os03g22810（铜/锌超氧化物歧化酶1，CSD1）, Os07g46990 （铜/锌超氧化物歧化酶2，CSD2），Os04g48410（铜/锌超氧化物歧化酶伴侣蛋白，CCSD），以及Os11g09780（铁/锰超氧化物歧化酶同源蛋白,SODX]的Cas9突变体材料，以及两个靶基因（CSD2 和 CCSD）的过表达转基因材料。通过对这些材料的抗性分析、抗病细胞学分析、H2O2累积分析，超氧化物歧化酶活性分析等几个方面来剖析miR398b对水稻稻瘟病抗性的调控机制，为构筑稻瘟病广谱抗性和水稻抗稻瘟病育种提供有力的理论依据和候选基因。..重要结果和关键数据： .1）OX398b对20个大田分离获得的稻瘟病菌株抗性增强或感病性减弱，提示miR398b参与调控水稻稻瘟病的基础抗性。.2） MIM398对亲和的稻瘟病菌株感病性增强，同时四个靶基因的mRNA水平增高，提示miR398b通过抑制四个靶基因的表达来增强抗性。.3）4个靶基因突变体的抗性表现有差异。其中csd1，csd2和sodx表现出减弱的感病性，而ccsd则表现出增强的感病性；靶基因过表达材料CSD2表现与突变体相反的表型，说明不同靶基因对稻瘟病抗性有不同的调控作用。.4）活性氧（ROS）分析结果说明接种稻瘟病菌后，OX398b，csd1，csd2和sodx累积更多H2O2，而ccsd累积的H2O2比对照减少。.5）超氧化物歧化酶活性检测发现OX398b，csd1，csd2和sodx中CSD酶活减弱，但稻瘟病菌侵染后诱发其他SOD基因表达增加，导致总的SOD 酶活增强，从而增加H2O2的累积，提高抗性。..科学意义：本研究揭示了同一miRNA调控的不同靶基因对水稻稻瘟病抗性有不同的作用，以及靶基因超氧化物歧化酶家族成员在稻瘟病侵染条件下会启动“家族基因表达及活性互补”，增强其他家族基因的表达，补充被miR398抑制的家族基因的表达和活性。