人附睾高/特异性表达的miRNA筛选及其调控精子成熟关键基因的机制研究

The development and maturation of spermatozoa is a highly complicated and well-organized process. The epididymis plays a crucial role in regulating the development of sperm motility and fertilizing capacity. As a result, study about its gene regulatory network will contribute to better understanding the molecular mechanism of spermatozoa maturation. microRNAs (miRNAs) represent a family of small non-coding RNA and are dispensable for the gene regulation network. In our early studies, we constructed a cDNA library of the small RNA in the epididymis of a fertile young man and revealed the diversity of small RNA families by deep sequencing. This research contributed to a preliminary database for their functional study in male reproductive system. This project aims at screening 2-3 abundantly and specifically expressed miRNAs, as well as their potential targets by computational prediction and experimental validation, so as to revealing the signal pathway they participate during spermatozoa maturation process. Besides, this study will also screen the miRNAs which are regulated by androgen, in order to identify the regulatory mechanism of miRNAs during the process of spermatozoa maturation.

精子的发生与成熟是一个高度复杂而有规律的细胞分化过程。附睾是精子成熟及获得受精能力的重要场所。因此，探究其基因调控网络有助于人们更好的了解精子成熟的分子机制。microRNA (miRNA)是一类小分子非编码RNA，它们是基因调控网络中不可或缺的核心成分。我们在早期的研究工作中建立了正常青年人附睾小RNA的cDNA文库，并通过大规模测序系统地揭示出人附睾小RNA的多样性，为后续的功能研究提供了数据平台。本项目拟借助各种分子生物学和细胞生物学手段，从前期测序结果中筛选出2-3个人附睾特异性表达及高表达的miRNA，通过计算机预测及实验验证它们潜在作用的靶分子，探究其在精子成熟过程中参与调控的细胞信号通路。另外，本研究拟筛选受雄性激素调控的miRNA及其靶mRNA分子，以期揭示这些miRNA在精子成熟过程中的分子调控机制。

精子在附睾中的成熟是一个高度复杂的过程，最终获得运动、识别卵子和受精潜能。目前，人们对参与附睾精子成熟的基因调控网络，尤其是miRNA的调控作用知之甚少。本项目主要完成了以下工作：.1. 在可育青年人附睾cDNA文库中筛选出特异性表达（miR-891a）及高表达的（miR-143-3p）miRNA。.2. 成功构建了大鼠的双侧去势模型。高通量测序共鉴定出266个新的附睾miRNA，完善了数据库。此外，筛选出59个差异表达的miRNA，其中5个miRNA随雄激素水平的变化呈现发育时序性表达。GO和KEGG分析表明，差异表达的miRNA靶分子主要参与代谢过程和MAPK信号通路。.3. 通过生物信息学预测和文献分析，验证了人miR-27a的靶分子为PHB1。PHB家族（PHB1和PHB2）为典型的高表达于人附睾的基因，定位于睾丸及附睾各种细胞的细胞质中。PHB1 和PHB2分别定位于精子尾部主段和头部赤道区。有意义的是，与正常精子相比，PHB2在临床弱精症患者精子上的定位率及表达丰度呈显著下调趋势。此外，通过腹腔注射阿霉素，构建了雄性大鼠生殖系统氧化应激模型。伴随睾丸生精小管形态改变及各级生精细胞的的严重氧化损伤，PHB家族的表达水平均显著下调，且有剂量依赖趋势。.4. 经验证，人miR-891a的靶分子为Stip1。Stip1在人各主要组织中均有表达，在睾丸和附睾中定位于各类细胞的细胞质中，且在大鼠中呈发育时序性表达模式。大鼠睾丸、附睾在热应激条件下，Stip1的表达会显著增高，表明Stip1与其他热应激蛋白如Hsp70和Hsp90等协同调控热应激条件下的基因表达。.5. 在小鼠睾丸中，发现输精管结扎诱导氧化应激并且在术后短期内PRDX上调。结扎后的睾丸MDA水平显著增高，发生组织损伤和凋亡，且呈现出时间依赖性及细胞特异性。在睾丸中，Prx1、Prx2和Prx3的水平在结扎后显著上调。除此之外，其他相关的抗氧化酶如Cat和Sod3在结扎后的睾丸中表达下调。该研究表明PRDX家族可以在抗氧化损伤中发挥重要作用。发现PRDX2在临床弱精症患者精浆和精子上表达水平低于正常人。.6. 成功表达并纯化TAT-PRDX2融合蛋白，且其能够顺利进入精子。更为有意义的是，TAT-PRDX2能够显著提高弱精症患者精子的前向运动能力，且精子DNA损伤程度得到了明显改善。