Cyclophilin D在FFA诱导内皮细胞坏死性凋亡中的机制研究

Necroptosis is a novel cell death pathway which is different from the apoptosis and necrosis . Our preliminary studies suggested that necroptosis was the main cause of endothelial cell death induced by septic lymph, the lipotoxicity of FFAs was a key factor. Recent studies shown that the combination of CypD and ANT can open the MPTP and led the cell to dead. So we speculated that CypD should be the key factor that FFAs induced endothelial cell to dead. On that basis, we will use the living cell workstation to dynamically detect the changes of MPTP on the mitochondrial of endothelial cells; Apply nec-1 to block necroptosis to identify the key role of RIP; Regulate downward and upward respectively the expression of CypD to research the function of CypD in endothelial cells; Application of microarray analysis to screen the target genes, looking for a pathway between RIP and CypD. The aim of this study is to elucidate the molecular mechanisms which FFAs induced endothelial cell to dead, and provide a theoretical basis for treating the sepsis.

Necroptosis是一种不同于凋亡和坏死的新型细胞死亡途径，前期研究提示它是脓毒症淋巴液致内皮细胞损伤的主要方式， 淋巴液中FFAs的脂毒性作用是关键因素。已知线粒体中CypD与ANT结合可使MPTP开放并导致细胞死亡，因此我们推测CypD是FFAs诱导内皮细胞坏死的重要靶点，具体机制有待阐明。课题组在此基础上，利用活细胞工作站动态检测线粒体膜上MPTP开放情况；应用nec-1阻断necroptosis信号通路，研究RIP对内皮细胞坏死的影响；应用siRNA技术下调CypD蛋白的表达水平，并建立CypD蛋白高表达内皮细胞模型，研究CypD在内皮细胞坏死中的作用机制；应用表达谱芯片分析筛选FFAs调控的下游靶基因，寻找RIP与CypD之间相关信号通路。本研究旨在全面阐明FFAs致内皮细胞坏死性凋亡的分子机制，为寻找新的脓毒症治疗途径提供理论基础和科学依据。

本课题组研究发现淋巴循环在脓毒症大鼠的炎症反应当中具有重要的作用。课题组一直从事淋巴液与脓毒症发病机制之间关系的研究工作，通过我们前期研究中成功建立的脓毒症大鼠盲肠结扎穿孔(Cecal Ligation and Puncture,CLP)动物模型以及大鼠胸导管淋巴液置管引流技术，并且该方法已发表在LYMPHOLOGY杂志上，得到了国际同行的认可。从我们的研究结果中可以证明脓毒症大鼠淋巴液对血管内皮细胞是有毒性的，并且这种毒性物质能够导致内皮细胞的坏死而不是过去报道的凋亡。我们通过MTT方法检测了内皮细胞的存活率，并通过流式细胞仪和电镜方法检测了内皮细胞损伤的情况，均发现内皮细胞发生坏死。我们又检测了内皮细胞坏死性凋亡的两个关键受体相互作用蛋白1（receptor-interacting protein 1，RIP1 ）和RIP3的表达情况，在脓毒症大鼠淋巴液作用下，内皮细胞中RIP1和RIP3的基因表达水平显著升高，因而从细胞形态和基因水平均支持我们的推测，脓毒症大鼠淋巴液诱导了内皮细胞的程序性坏死。我们已知线粒体中Cyclophilin D(CypD)蛋白与腺核苷酸移位酶(adenine nucleotide translocator ANT)结合可使MPTP开放并导致细胞死亡，因此我们推测CypD有可能是FFAs诱导内皮细胞坏死的重要靶点。由于获得的是一年期的小额探索项目，在实验设计上与面上项目研究内容略有改变，课题组在研究过程当中首先重点探讨了淋巴循环在脓毒症发病机制当中发挥了何种作用。我们主要通过两个方面实验进行阐述。首先我们利用CLP方法造脓毒症大鼠模型，然后分不同时间点再结扎大鼠的胸导管，观察大鼠的术后死亡率明显增高，并且死亡的时间提前，和对照组比较有显著性差异。另外，我们对脓毒症大鼠胸导管采取了置管引流手术，在造模同时进行的引流手术大鼠的死亡率没有显著变化，但是在造模后6h再进行的引流手术大鼠死亡率明显下降。本研究再次证实了淋巴液在脓毒症发病机制中的重要作用。我们继续将脓毒症大鼠淋巴液作用于脐静脉内皮细胞后通过CCK8检测可以发现内皮细胞的损伤。通过流式细胞仪检测可以发现脓毒症大鼠淋巴细胞在继续进行线粒体损伤的研究当中，由于时间有限还没有得到很好的结果，这一部分实验将在之后继续进行深入的研究。