蛋白质糖基化修饰的高通量质谱检测技术

Glycosylation is the most common form of protein modifications. Each glycoprotein can be glycosylated at different glycosites and each glycosite may be modified by different glycans. This structural heterogeneity has complicated the study of the structure-function relationships of glycoproteins. In this study, we report a method for the rapid identification and quantification of the glycosylation on particular glycosites from complex biological mixtures using glycan-lectin affinity and chemical immobilization, followed by mass spectrometry. We showed the high-throughput identification of protein glycosylation in human plasma using this method. The application of this method may facilitate our understanding of how perturbed glycosylation impacts upon disease progression and could be used to discover glycosylated proteins that could serve as biomarkers or therapeutic targets to improve clinical outcomes of patients.

糖蛋白是重要的糖复合物，蛋白质糖基化修饰是蛋白质翻译后修饰的重要组成部分。与磷酸化、甲基化等修饰相比，蛋白质的糖基化位点不同和每个糖基化位点的糖链结构不同构成了糖基化修饰的"不均一性"。这种不均一性极大地限制了蛋白质糖基化修饰的分析，是糖组学领域中所面临的重大挑战。本课题组在已有的糖蛋白质组学和糖组学的研究基础上，结合凝集素快速识别、化学富集（氧化酰肼法SPEG）、和同位素标记的高分辨率质谱检测等技术，实现了快速灵敏的蛋白质糖基化修饰的定性定量分析，可以同时检测糖蛋白和糖多肽的氨基酸序列、糖基化位点、每个糖基化位点上的糖链特异性结构（motif）和分子表达水平。这种技术可以实现在人体血液组织等样品中的高通量分析，进而建立人体蛋白质特异性糖基化修饰数据库。作为新型的高通量糖组学分析技术，这种技术为基础研究和临床应用提供了有力的糖复合物分析工具和技术支持。

本研究首先在现有的蛋白质学技术和糖组学技术的基础上，综合利用凝集素识别、氧化酰肼法、同位素标记法和高灵敏度质谱检测技术等多种生物技术的优势，综合凝集素识别法和氧化酰肼法设计新型实验方案，结合两种方法的优势，突出凝集素对糖链特异结构的识别能力和氧化酰肼法的高特异性富集能力，首先通过多种凝集素特异识别糖蛋白的不同特异性糖链结构，然后使用氧化酰肼法高效提取糖多肽，实现复杂样品中蛋白质糖基化修饰的高通量高灵敏度的定性定量检测,实现复杂生物样品中快速灵敏的蛋白质特异性糖基化修饰的定性定量分析。.随后，本研究应用这种技术对人体蛋白质糖基化进行分析，并在临床样品中完成了两种疾病相关研究。首先，在甲状腺疾病中完成了甲状腺球蛋白抗体（TgAb Ig G）的糖基化水平分析，根据疾病HT组和对照组中多种凝集素与糖链结合的信号，用来比较mHT和hHT组之间TgAb IgG中不同寡糖含量的表达水平。实验结果表明HT患者体内TgAb IgG的糖基化水平高于比健康对照组，本研究为探索TgAb在桥本氏甲状腺炎发病机理的具体作用提供了新的依据。.在肠癌研究中，癌胚抗原（CEA）是一个广泛用于预测肠癌的糖蛋白，但随着肠癌的发生和发展，CEA糖基化的变化和肠癌进展的关系还需要进一步了解。我们使用质谱与高通量芯片分析了53个肠癌病人（Ⅰto Ⅳ期）癌和癌旁组织中的CEA糖基化的变化。通过9个凝集素的联合信号可以把肠癌组织和癌旁组织区分开来，灵敏度和特异性分别为83.0%，90.6%。本研究阐述了随着肠癌的发展，CEA上糖基的变化情况，有助于提高CEA在肠癌早期诊断中的临床应用价值。.综上所述，本研究结合了凝集素芯片技术与高分辨质谱技术，提供了一种新型的适用于临床研究的高通量糖组学分析技术，并完成了两种疾病标志物的糖基化研究，本研究为蛋白质糖基化的生物学研究和临床应用提供了新型分析手段。.本研究在执行期内发表研究论文3篇，完成论文1篇投稿中，培养硕士生3人，博士后1人。