利用光电联合方法研究真核细胞内染色质高级结构

The eukaryotic genome is hierarchically packaged into the nucleus. During the past decades, it became evident that the packaging of DNA by histones into chromatin plays a key role in transcription regulation and other nuclear processes that involve DNA. .The structure of the first level of DNA organization, the nucleosome core, has been determined to high resolution. Nevertheless, the structure of next level of DNA compaction, the ‘30 nm’ fiber, has remained highly controversial. Recently, our laboratory and collaborators have solved the cryo-EM structure of 30 nm chromatin fibers reconstituted in vitro, which shows a zigzag two-start helix twisted by tetranucleosome units. However, the existence of 30 nm fibers in nuclei remains to be elucidated, not to mention the definition of the trajectory of DNA in the chromatin fibers due to poor contrast of DNA..In this study, to address this question, we have developed a novel ruthenium (Ru) polypyridyl system that works as a multifunctional biological imaging agent to stain the DNA of living cells specifically for both luminescence light microscopy (LM) and transmission electron microscopy (EM). This new approach will not only help to enhance the contrast of DNA to define its trajectory, but also reveal the dynamic chromatin structure by correlative light and electron microscopy (CLEM). By applying this new approach in mammalian cells, we identified numerous long-rang fibers in width of 30 nm. More importantly, the outline of nucleosomes and most of the linker DNA could be readily recognizable with the help of the Ru stained DNA. According to these preliminary results, the architecture of the chromatin fiber in vivo can be well anticipated to be analyzed by 3D-electron tomography (ET) with a good resolution.

真核细胞中，DNA以染色质的形式存在，包括转录在内的一系列与DNA相关的生物过程都需要通过染色质高级结构的动态调节来实现。先前的研究中，申请人所在研究组利用冷冻电镜三维重构方法解析了体外组装的30 nm染色质的左手双螺旋高级结构，发现DNA的缠绕方式为“之”字形。然而，真核细胞内是否真的存在30 nm染色质至今仍存在很大争议。如果存在，如何确定DNA的缠绕方式又是一大难题。本项目中，我们拟利用钌盐复合物特异性结合DNA后发射荧光的性质建立一种新型光电联合方法研究真核细胞内染色质结构。此方法不仅可以在光镜下定位染色质以便电镜观察，而且还将大幅度地增加DNA的衬度，使研究DNA在染色质上的缠绕规律成为可能。初期的研究中，我们可以清楚地观察到哺乳动物细胞内疑似30 nm染色质的大量存在，且DNA缠绕的核小体的轮廓以及部分连接DNA的缠绕轨迹也清晰可辨，为拟解析的体内染色质高级结构提供了优良基础。

通过多年的研究人们发现，真核细胞中DNA是以染色质的形式存在的。DNA通过逐级折叠压缩形成高级结构储存于细胞核中，而且染色质的折叠机制与基因转录、复制和修复密切相关。在本研究中，我们采用一种新型的光电联合DNA染料－钌盐复合物，利用其特异性结合DNA的特点，提高染色质DNA的荧光与电镜信号，而后结合电子断层三维重构技术，开展细胞核内染色质的高级结构研究。通过光电联合的方法，我们成功定位到了鸡血红细胞核以及HeLa细胞中的染色质纤维。其中前者以30 nm染色质形态为主，而后者则以串珠形态为主。.在光电联合的基础上，我们尝试了电子断层三维重构。结果显示，鸡血红细胞核内确实存在大量的30 nm染色质，并且非常密集，可能与其异染色质的性质有很大关系。而在HeLa细胞中，我们发现一些染色质较为稀疏的常染色质区域染色质结构比较松散，基本以10 nm尺寸居多，可能主要是一些串珠状的结构。但是也可以观察到少量的30 nm染色质存在。然而，在提取的HeLa细胞核样品中，我们又能较为清楚的观察到大量30 nm染色质的存在。通过荧光漂白恢复实验，我们推测两个体系中染色质形态的不同很可能与连接组蛋白的动态结合方式有关。综上所述，本研究先通过光电联合的方法验证了钌盐染色技术的可行性，而后解析了几种细胞内的染色质结构。将体外研究与体内研究联系起来，为揭示表观遗传规律与染色质结构动态变化之间的关系提供了重要依据。