鸡脂肪生成中多启动子调控PPARγ基因的机制研究

PPARγ is the master regulator of adipogenesis. Our previous study for the first time demonstrated that chicken PPARγ gene has three distinct promoters, and due to differential promoter and alternative splicing, it produces five transcript isoforms and two protein isoforms (PPARγ1and PPARγ2). To date, how these three promoters regulate chicken PPARγ gene expression in adipogenesis remains unknown. To this end, in this project we are proposing to investigate transcriptional and epigenetic regulation of these three promoters of PPARγ gene in chicken adipogenesis, and dissect the regulatory roles and molecular mechanisms of 5´UTRs in the posttranscriptional and translational regulation of chicken PPARγ gene using reporter gene and in vitro transcription/translation assays. We also will decipher the difference in the molecular characteristics and function between chicken PPARγ1and PPARγ2. This project will clarify how the the alternative promoters regulate chicken PPARγ gene at transcriptional, posttranscriptional and translational levels, contribute to a better understanding of the molecular mechanisms underlying chicken adipogensis, and provide clues to molecular breeding for lean broiler. The results from this project will also shed light on molecular mechanisms of human adipogenesis.

PPARγ是脂肪生成最重要的调控因子。我们近期的研究首次发现鸡PPARγ基因有3个不同的启动子，由于启动子的不同和选择性剪切，鸡PPARγ基因可产生5个转录异构体和2个蛋白异构体（PPARγ1和PPARγ2）。目前，鸡PPARγ基因的3个启动子调控该基因表达的机制还不清楚。本项目拟开展鸡PPARγ基因3个启动子的转录调控和表观调控遗传分析；采用报告基因技术和体外转录/翻译等技术，分析5＇UTR在转录后和翻译水平上的调控作用及其分子机制；开展鸡PPARγ1和PPARγ2蛋白分子特性及功能差异的分析。本研究将揭示鸡脂肪生成中多启动子在转录、转录后及翻译水平上调控PPARγ基因表达的机制，研究结果将增进人类对鸡脂肪生成分子机制的了解，促进优质低脂肪肉鸡的育种工作。

PPARγ是脂肪生成的关键转录调控因子。我们的早期研究发现，鸡PPARγ基因是一个多启动子调控的基因，它有3个启动子（P1、P2和P3），由于选择性拼接和多启动子的使用，鸡PPARγ基因可以产生5个不同的转录本（cPPARγ1、cPPARγ2、cPPARγ3、cPPARγ4及cPPARγ5），编码2个蛋白异构体（PPARγ1和PPARγ2）。在前期对P3启动子的转录调控和DNA甲基化分析的基础上，本项目重点开展了P1和P2启动子的转录调控和DNA甲基化分析、5′UTR介导的PPARγ基因转录后调控，以及两个PPARγ蛋白异构体的功能和分子特性比较研究。研究发现，NRF1和KL2直接负调控P1启动子，抑制cPPARγ1的表达，而E2F1直接正调控P1启动子，促进cPPARγ1的表达。P2启动子的转录调控分析发现，过表达KLF3显著抑制P2启动子活性（p < 0.01），而过表达KLF2和KLF7则显著促进P2启动子活性（p < 0.01）。DNA甲基化分析发现，2周和3周龄高、低脂鸡腹部脂肪组织P1启动子（-412/+52 bp）的甲基化总体水平无显著差异（p > 0.05）；而7周龄高脂鸡腹部脂肪组织P1启动子的甲基化总体水平显著高于低脂鸡的（p < 0.05）。与P1启动子不同，2周、3周和7周龄高、低脂鸡腹部脂肪组织P2启动子（-521/+48 bp）甲基化的总体水平无显著差异（p > 0.05）。报告基因和EMSA分析提示，DNA甲基化会阻止转录因子NRF1与P1启动子的结合，从而解除NRF1对P1启动子的负调控作用。生物信息学分析显示，鸡PPARγ基因5个转录本5′UTR的序列和长度不同，其中有3个转录本的5′UTR存在uORF。实验分析发现，PPARγ基因5个转录本的5′UTR具有不同的转录后调控作用；uORF抑制cPPARγ1、cPPARγ3和cPPARγ5三个转录本下游PPARγ ORF的翻译。蛋白异构体的功能分析显示，过表达PPARγ1和PPARγ2均抑制鸡前脂肪细胞的增殖，促进前脂肪细胞的凋亡和分化，相比而言，PPARγ2的作用强于PPARγ1。分子特性分析发现，PPARγ2的转录激活活性及DNA结合能力均强于PPARγ1。本研究的成果增进了人类对鸡PPARγ基因遗传和表观遗传调控的了解，有助于最终揭示鸡脂肪生成和脂肪生长发育的分子机制。