miR-17-92基因簇在鸡脂肪生成中的功能及其调控机制研究

miR-17-92 cluster plays important roles in development and carcinogenesis in mammals. However, its roles and regulatory mechanisms in chicken are still unknown. The first aim of this project is to investigate the roles of miR-17-92 cluster in chicken preadipocyte proliferation and differentiation by establishing stable cell line. The second aim is to identify its target genes and cell signaling pathways using 2D-DIGE/MS and signal transduction reporter array, and to further experimentally determine its major target genes and cell signaling pathways in chicken adipogensis. The last aim is to isolate the unknown sequence upstream of miR-17-92 cluster using chromosome walking, determine its promoter region using promoter reporter assays, and to further investigate its transcriptional regulation and epigeneic regulation. This project will clarify the roles and the transcriptional and epigenetic regulatory mechanisms of miR-17-92 cluster in chicken adipogenesis, contribute to understanding the molecular mechanisms underlying chicken adipogensis, and provide the theoretical basis for improving broiler breeding program. The results from this project will also shed light on molecular mechanisms and cell signaling pathways of human adipogenesis.

miR-17-92基因簇在哺乳动物的生长发育和癌症发生中发挥着非常重要的作用，但该基因簇在鸡生长发育中的功能及其调控机制尚不清楚。本项目拟建立稳定表达细胞系分析miR-17-92基因簇在鸡前脂肪细胞增殖和分化中的作用；采用蛋白质组学方法（2D-DIGE/MS）和信号通路分析芯片筛选鸡miR-17-92基因簇的靶基因和靶信号通路，实验确定该基因簇在鸡脂肪细胞增殖和分化中的重要靶基因和重要信号通路；采用染色体歩移法获得鸡miR-17-92基因簇上游的未知基因组序列，进而采用报告基因技术等确定其启动子区，开展其转录调控和表观遗传调控分析。本研究将揭示miR-17-92基因簇在鸡脂肪生成中的功能，阐明miR-17-92基因簇在鸡脂肪生成中的转录调控和表观遗传调控机制。研究结果将增进人类对鸡脂肪生成分子机制的了解，促进优质肉鸡的选育和分子育种工作。

miR-17-92基因簇在禽类中的作用和作用机制尚不清楚。我们前期的表达分析研究提示，miR-17-92基因簇可能在鸡脂肪细胞增殖和分化中发挥调控作用。在本项目中，我们开展了miR-17-92基因簇在鸡脂肪细胞增殖和分化中的作用和作用机制研究，以及miR-17-92基因簇的转录调控和DNA甲基化分析研究。研究发现，过表达miR-17-92基因簇促进鸡前脂肪细胞和DF1细胞的增殖，但抑制鸡前脂肪细胞的分化。本项目鉴定出了鸡miR-17-92基因簇的靶基因MAP3K2、ZFPM2、LIN9、DDX5、TP53inp1、LRIG1、ELK3及CAMAT1。靶基因功能分析显示，过表达MAP3K2和LIN9均抑制鸡前脂肪细胞和DF1细胞的增殖，而干扰ZFPM2促进鸡前脂肪细胞的增殖。进一步研究发现，miR-17-92基因簇至少部分通过靶作用于MAP3K2提高C-myc基因的表达，从而促进鸡细胞的增殖。高通量信号通路芯片和报告基因分析发现，miR-17-92基因簇在鸡脂肪细胞分化中靶作用于NFκB和BMP等信号通路；在鸡前脂肪细胞增殖中靶作用于Wnt、BMP、NFκB等信号通路。本项目定位了鸡miR-17-92基因簇宿主基因（MIR17HG）的启动子区，发现LEF1、NFYA、E2F1、ETS1 和C-Myc能提高鸡MIR17HG启动子的活性。对LEF1的进一步研究发现，如果突变启动子区LEF1的结合位点，LEF1不能提高鸡MIR17HG启动子的活性；β-catenin也丧失增强LEF1促进MIR17HG启动子活性的能力。另外，本项目还发现鸡miR-17-92基因簇上游的A/T富集区具有启动子活性。DNA甲基化分析发现，2、3和7周龄东北农业大学高、低脂系肉鸡脂肪组织MIR17HG的启动子区都存在一定程度的DNA甲基化，在2周龄时，低脂鸡MIR17HG启动子的甲基化总体水平显著高于高脂鸡，有4个CpG位点的甲基化程度在高、低脂鸡间存在显著差异（p<0.05）。但3周龄和7周龄高、低脂鸡脂肪组织MIR17HG启动子的甲基化均无显著差异。体外甲基化分析发现，甲基化的MIR17HG启动子活性显著低于未甲基化的MIR17HG启动子活性（p<0.05），提示DNA甲基化调控miR-17-92基因簇的表达。本研究的成果将增进人类对鸡脂肪生成机制的了解，促进优质肉鸡分子育种工作。