从海洋疣孢菌属中勘探和挖掘抗结核分枝杆菌活性的小分子

Microbial secondary metabolites (MSM) have been an important resource for tuberculosis therapeutics (tuberculosis will be the major infectious disease in next 20 years in China). Intriguingly, many anti-TB MSM are derived from Mycobacterium neighboring genus in taxonomy. Recent advances have been made to accelerate the discovery rate of novel anti-TB drugs including strategies for high-throughput screening from proprietary MSM library, evidenced by isolation of series of new species in Verrucosispora from South China Sea [1]. The resulting compounds, new abyssomicins, proximicins and others, show potent anti-TB activities [2]. In this project, we will focus on bioprospecting of diversity, bio-activities, biosynthesis mechanisms, induction and high efficient production of MSM in dozens of Verrucosispora species by genome mining, activation of cryptic gene clusters and NanoDESI-MS/MS networking techniques. Results gained from the above research will shed lights on discovery of novel anti-TB drug leads and understanding of the evolutionary path of TB.

微生物天然产物是发现药物先导化合物的重要源泉。结核病被公认为中国未来20年第一大传染病，非常有意思的是，很多抗结核天然药物都来自于分类学上临近分支菌属的微生物菌株。我们前期从自主构建的我国南海海洋微生物代谢产物库中高通量筛选获得多株海洋疣孢菌新种[1]，其abyssomicin、proximicin类和其它新化合物等都展现出抗结核活性[2]。本研究拟从基因组角度出发，利用基因组挖掘（genome mining）策略，结合多种激活沉默基因簇手段和灵敏的二级质谱小分子网络（NanoDESI-MS/MS networking）检测技术，对实验室海洋疣孢菌菌株次级代谢产物的多样性、生物活性、合成机制、新颖同系物的诱导产生，以及高效表达进行深入的研究，为新型抗结核药物的发现和探索协同进化的奥秘提供理论和物质基础。

在构建了丰富多样的微生物菌种库基础上，依据OSMAC策略，采用多种不同培养基刺激疣孢菌其产生次级代谢产物，结合高通量筛选手段和本实验室建立的以细胞为靶标的抗BCG筛选模型，从中鉴定出包括2个具有抗结核活性的新proximicinD,E合物在内的五个proximicins类化合物，一个新的abyssomicin Y和3个已知abyssomicin类化合物, 以及具有抗结核活性的brevianamide F。对一个MS100047的基因组进行分析，对次级代谢产物生物合成基因簇，包括PKS，NRPS等共18个次级代谢产物生物合成基因簇进行了挖掘。首次将CRISPR/Cas9应用于疣孢菌，进一步优化CRISPR/Cas9，实现对其基因组的高效率删除、插入和突变等。建立了细菌别构转录因子和CRISPR/Cas12a建新一代小分子传感和检测平台，简称CaT-Smelor。该技术不仅既能实现复杂发酵培养液的快速灵敏检测，也可用于临床疾病标志物和目标代谢产物的精确定量分析。为了确证疣孢菌中CRISPR/Cas9的关键作用，我们将以该技术为基础，结合调控因子改造、异源表达以及基因簇重构等方式，激活基因组中一个沉默基因簇，获得新颖活性化合物。在aby删除菌株中，abyssomicin类产物完全消失，这使得我们可以检测到野生菌株中产量低的新proximicin类化合物。利用链霉菌胞内TAGs在衔接初级代谢和聚酮合成过程中起着关键作用的特点，设计了一种新的“TAG动态降解（ddTAG）”工程策略。这一研究为深入揭示链霉菌中TAGs降解和聚酮类药物合成的代谢机制，进而充分利用可再生TAGs资源，实现聚酮类药物乃至其他次级代谢生物活性产物高效、绿色、智能的生物制造开辟了新思路。项目发表包括Nat. Biotechnol，Nature Communications，Science advance, Appl Microbiol Biotechnol.等在内的文章27篇，专利3件。在此项目的支持下培养研究生10人，博士后4人，本项目的工作为项目主持人获得自然科学二等奖奠定了技术基础，同时项目主持人获得2017年第十一届药明康德生命化学研究奖，国家杰出青年基金考核优秀。培养的多名研究生获得国际代谢科学大会以及第三届合成微生物学与生物智造暨第八届生物催化与生物合成工程国际学术研讨会展板奖。