疣孢菌CRISPR/Cas9基因组编辑技术的建立和评价

Verrucosispora is proved to be capable of great potential for active natural products in our lab, including abyssomicins and the proximicins with anti-TB activity. However, only a few Verrucosispora derived compounds were reported due to its deficient genetics, which is needed to be overcome urgently..In this project, we will introduce CRISPR/Cas9, a rising highly efficient genome editing technology to Verrucosispora for the first time. Specifically, we will try to achieve genome editing with high efficiency, in forms of gene deletion, replacement, mutation, etc., in a marine-derived fertile Verrucosispora sp. strain MS100137 with tens of cryptic secondary metabolite gene clusters. Finally, for the validation and as a proof of concept, a potential cryptic gene cluster in MS100137 will be activated by the combination of various CRISPR/Cas9 based ways, e.g. regulator modifications, pathway reconstruction, heterologous expression, and so on..This study will provide a complete genetic tool for further investigation of genus Verrucosispora. Our results will confirm the great potential of Verrucosispora by the isolation of novel active compounds as well.

本实验室从疣孢菌中获得多个抗TB活性化合物，如abyssomicin和proximicin等。然而疣孢菌传统遗传操作体系的缺陷，严重阻碍了研究的深入。因此我们迫切需要建立和完善疣孢菌高精准度、高效率的遗传操作体系。.近年来兴起的CRISPR/Cas9基因组编辑技术由于其高效率、高精准度等优点可以很好地弥补传统手段低效率等缺陷。本研究中我们将以一株富含基因簇的疣孢菌MS100137作为研究对象，第一次尝试将CRISPR/Cas9应用于疣孢菌，进一步优化CRISPR/Cas9，实现对其基因组的高效率删除、插入和突变等。为了确证疣孢菌中CRISPR/Cas9的关键作用，我们将以该技术为基础，结合调控因子改造、异源表达以及基因簇重构等方式，激活基因组中一个沉默基因簇，获得新颖活性化合物。.本研究将最终完善疣孢菌遗传操作体系，在获得新颖活性化合物的同时，也为深入挖掘疣孢菌代谢潜能打下了坚实的基础。

疣孢菌基因组中所含有次级代谢产物基因簇的数量远远高于其中所发现的化合物，这提示了从该属中发现新颖活性化合物的巨大潜力。我们发现，疣孢菌在多种发酵条件下生长缓慢，并且其遗传操作效率很低，这些缺点严重制约了对其潜力的深入挖掘。因此，开发疣孢菌高效的遗传操作体系具有重要的意义。.本研究尝试利用CRISPR/Cas9技术来实现对疣孢菌基因组的高效精确的编辑。我们首先利用已报导的pCRISPR-Cas9质粒成功删除了疣孢菌MS100137中lycopene基因簇（lyc），证明了Cas9可在疣孢菌中正常行使功能。然而，该系统在后续质粒丢失以及高重复区域的编辑研究中，并未表现出较高的效率。因此我们优化设计了pQS编辑系统用于编辑：包括pQS-idgS和pQS-gusA两个质粒。质粒中不稳定复制子pIJ101可实现质粒丢失，idgS和gusA作为报告基因用于筛选质粒丢失克隆子。利用该系统，我们成功删除了MS100137基因组中lyc和abyssomicin基因簇（aby），并且实现了质粒的快速丢失。此外，由于报告基因的引入，我们可直接排除假阳性接合子，使得该2个基因簇删除的效率达到了100%。更重要的是，在不降低效率的情况下，此系统大大降低了获得目标突变株所需的时间和工作量。.我们进一步尝试对MS100137基因组中沉默基因簇进行激活。首先，对基因组中数个基因簇进行删除，然而大部分突变株代谢产物中均未检测到明显的产物变化。在aby删除菌株中，abyssomicin类产物完全消失，这使得我们可以检测到野生菌株中产量低的新proximicin类化合物。基于此突变株，我们进一步分离获得了新化合物proximicin D和E，它们抗BCG的MIC值分别3.125 μg/mL和6.25 μg/mL，均优于目前已知所有proximicin类化合物。另一方面，我们选择NRPS类基因簇C17，在其核心基因上游敲入组成型启动子，以期激活该基因簇。对随机挑取的克隆子进行验证，发现成功编辑的效率达到100%，然而发酵产物中却未检测到新化合物的产生。.本项目成功构建了疣孢菌的CRISPR/Cas9操作平台，实现了对其快速、高效和精确的编辑。将来，我们可以利用该遗传操作平台深入挖掘疣孢菌属，乃至其他生长缓慢的稀有放线菌中所蕴含的次级代谢潜能。