HIF介导的Connexin46表达对晶状体缝隙连接通道形成及功能的影响

Gap junction channel formed by connexin46 （Cx46）plays a vital role in the transportion of messages and metoblics between lens cells. Deletion,degredation, or interruption of Cx46 channel function may lead to cataract formation due to dysregulation of lens homeostasis. However, overexpression of Cx46 could prevent cataract formation. Thus researchs on the regulation of Cx46 expression has great significance. Our previous studies showed upregulation of Cx46 in hypoxic environment. We also detected hypoxia response element in the promoter of GJA3, indicated that HIF plays a vital role in the regulation of Cx46 expression. But its action mechanism remains elusive.In this project ,we will identify the HIF subunits interacting with Cx46 using ChIP,siRNA, lentivirus transfection, immunofluorescence, immunogold labeling and patch clamp techniques. We focus on identification of influence of HIF subunits-mediated Cx46 expression on gap junction channel formation and function, representing a new target of cataract therapy.

由Connexin46(Cx46)构成的缝隙连接通道在人晶状体细胞间信号转导及代谢传递中发挥重要作用。Cx46缺失、降解或功能异常均可破坏晶状体生理稳态，诱发白内障，而其过表达可抑制白内障形成。因此，探索Cx46表达的调节通路对预防白内障发生发展具有重要意义。我们前期研究发现缺氧可提高人晶状体上皮细胞中Cx46蛋白表达，并在Cx46编码基因—GJA3的上游转录起始序列中鉴定出低氧诱导因子（HIF）结合位点，提示HIF是参与Cx46调节的重要因素。然而其具体调控方式及继发分子生物学效应尚有待阐明。本课题拟应用染色质免疫共沉淀、siRNA、慢病毒感染、免疫荧光、胶体金免疫标记、膜片钳等技术，鉴定能够激活GJA3转录的HIF亚基，并明确由HIF亚基介导的Cx46表达对晶状体缝隙连接通道形成及功能的影响和潜在机制，为以Cx46为靶点预防治疗白内障奠定基础。

由Connexin46(Cx46)构成的缝隙连接通道在人晶状体细胞间信号转导及代谢传递中发挥重要作用。Cx46缺失、降解或功能异常均可破坏晶状体生理稳态，诱发白内障，而其过表达可抑制白内障形成。因此，探索Cx46表达的调节通路对预防白内障发生发展具有重要意义。白内障是视网膜色素变性的最常见并发症，然而其具体致病机制至今不明。本研究通过比较患有白内障的视网膜色素变性患者与老年性白内障患者眼房水中细胞因子表达情况，来探索视网膜色素变性患者白内障发生发展的机理。. 本项目前期研究发现缺氧可提高人晶状体上皮细胞（HLEC）中Cx46蛋白表达，并在Cx46编码基因—GJA3的上游转录起始序列中鉴定出低氧诱导因子（HIF）结合位点，提示HIF是参与Cx46调节的重要因素。分别构建HIF关键亚基HIF1α、HIF2αsiRNA质粒后，转染HLEC后发现HIF1αsiRNA转染组Cx46表达量减少，而将HIF1α在HLEC中过表达后则显示Cx46表达量明显增高，提示HIF1α亚基是参与Cx46表达调控的关键亚基。HIF1α转染HLEC后，免疫荧光显示Cx46所形成缝隙连接数增多，细胞摄取染料的通透性明显增强，进一步证实了HIF1α亚基对Cx46表达的正向调控作用。通过本研究鉴定了能够激活GJA3转录的HIF亚基，并明确由HIF亚基介导的Cx46表达对晶状体缝隙连接通道形成及功能的影响和潜在机制，为以Cx46为靶点预防治疗白内障奠定基础。. 通过多通路免疫荧光技术显示，患者有白内障的视网膜色素变性患者与年龄相关性白内障患者相比，眼房水中多种细胞因子（MCP-1, IL-8, IP-10, HGF, PDGF-AA, MMP-2, MMP-3, MMP-7, MMP-8, PAI-1, TSP-2）明显增加，提示这些细胞因子可能与视网膜色素变性患者白内障的发生有直接关系，为下一步预防和治疗提供了线索。