云南人结肠癌细胞系的建立及NDRG1基因在其侵袭转移中的作用研究

Our immunochemistry result of NDRG1 in colorectal carcinoma of Chinese origin is opposite to that of the report by the author who first identified this gene. In order to investigate whether the expressions of NDRG1 in colorectal carcinoma is specific in different human beings, we plan to build the colorectal carcinoma cell lines from Yunnan colorectal carcinoma patients, and screen the cell lines with high or low expression of NDRG1 gene for the further study. This study plans to examine the proliferation, mobility, and invasion of the NDRG1 transfected cell lines in vitro, and the metastasis to lung and liver in vivo. we also plan to further investigate the signal transduction pathway of NDRG1 via different inhibitors of MAPK pathways in vitro and in vivo.

基于我们前期利用中国人种人体材料所做的NDRG1免疫组化结果，与NDRG1发现者的结果相反，为探寻NDRG1表达特点及与结肠癌的关系是否与人种有关，本实验拟通过建立云南人结肠癌细胞系（样本为三代均系云南人的结肠癌患者），并筛选出高表达及低表达NDRG1基因的细胞株，为云南人结肠癌的防治研究提供理想的体外研究材料，同时通过多种体外实验分析结肠癌细胞系（低表达NDRG1基因的细胞株）转染NDRG1前、后细胞生长速度、运动和侵袭能力等，并将转染前、后的瘤细胞接种于裸鼠肾包膜下观察其局部侵袭和肺、肝转移率，从而分析NDRG1基因与结肠癌侵袭和转移的关系。并用MAPK途径的有关抑制剂（PD98059，GW5074及PD98059+ GW5074）与高表达NDRG1的结肠癌细胞株共培养，通过多种体外实验方法和体内实验，初步探寻NDRG1基因在结肠癌侵袭转移过程中是否通过MAPK信号转导途径发挥作用

基于我们前期利用中国人种人体材料所做的NDRG1免疫组化结果，与NDRG1发现者的结果相反，为探寻NDRG1表达特点及与结肠癌的关系是否与人种有关，本实验利用多种体外实验方法分析云南汉族大肠癌中NDRG1全长基因克隆和特征，比较亚洲人结肠癌细胞系SNU-C1和高加索人结肠癌细胞系CACO2的运动能力、增殖速度、侵袭能力、迁移能力、超微结构变化、细胞周期等，体内观察比较SNU-C1和CACO2结肠癌细胞株局部侵袭和肺、肝的转移率，并通过多种体外实验检测转染NDRG1前后CACO2细胞的运动能力、生长速度、侵袭能力、超微结构变化、细胞周期以及培养细胞形态结构和代谢的变化等。得出在核苷酸序列水平上高加索人结肠癌细胞与云南人结肠癌细胞NDRG1基因是无差异的，而在mRNA水平，云南人结肠癌细胞NDRG1的表达远远高于高加索人结肠癌细胞；体外培养CACO2细胞的增殖速度比SNU-C1细胞快；在mRNA水平，SNU-C1细胞NDRG1的表达高于CACO2，说明SNU-C1细胞NDRG1的蛋白表达活跃；同等条件下CACO2的侵袭能力高于SNU-C1，而迁移能力在24h时以SNU-C1的为高，但在48h和72h均以CACO2的为高，且均有统计学意义；CACO2与SNU-C1两种细胞各间期率无差异；扫描电镜两种细胞未见差别；体内CACO2结肠癌细胞株增殖速度也比SNU-C1的快；转染NDRG1后CACO2细胞G0/G1期细胞比例增多，S期比例明显降低，且侵袭能力和迁移能力均有所减弱，扫描电镜见细胞表面伪足及微绒毛少见，细胞间连接减少，透射电镜见胞质内含有较多的线粒体及内质网、高尔基复合体、微丝等细胞器结构，还可见早期凋亡细胞；利用MAPK途径的抑制剂（PD98059，GW5074，PD98059+GW5074）进行药物干预，显示CACO2结肠癌细胞的体外侵袭和迁移能力降低，NDRG1蛋白的表达明显上调。提示CACO2细胞和SNU-C1细胞NDRG1蛋白表达多时体外侵袭和迁移能力降低，阻断Raf/MEK/ERK通路，可诱导CACO2结肠癌细胞发生分化或促进细胞凋亡，可抑制CACO2结肠癌细胞的体外侵袭、迁移能力。