红系分化相关miRNA的表达调控研究

MiRNA作为体内一类重要的调节分子，其在造血红系分化过程中的功能和作用机制已被陆续发现。然而，却较少有研究者考察这些miRNA在红系分化中自身表达的调节因素，而这对完整揭示miRNA在红系调控网络中的地位和作用具有重要意义。本课题在前期已经明确miR-223、miR-103和miR-376a在红系分化过程中功能的基础上，结合针对红系分化关键转录因子GATA-1、EKLF和NFE2的高通量ChIP-chip分析，获得了它们对这些miRNA表达调节的直接线索。在此基础上，我们将进一步在体外和体内红系分化模型中验证GATA-1、EKLF和NFE2对miRNA的表达调控，并详细考察其调控机制，进而研究miR-223、miR-103和miR-376a在转录因子调节下参与红系分化的功能机制。这将为阐明红系分化相关miRNA的自身表达调节，以及丰富和完善已有的红系分化调控网络奠定基础。

本课题基于红系分化相关miRNA的表达特征，以红系分化关键的转录因子GATA-1、EKLF、NF-E2为切入点，研究和探索调节miRNA表达的转录因素，并通过转录因子-miRNA-靶基因之间作用关系的揭示，进一步完善和丰富miRNA在红系分化调控网络中的作用的地位。通过高通量ChIP-chip分析，我们首先获得了转录因子在miRNA上游结合的直接线索。我们主要选择miR-23a作为后续研究对象，重点研究GATA-1对它的调控作用和分子机制，以及miR-23a如何协同GATA-1调节红细胞的发育成熟。K562细胞中的ChIP-PCR结果显示，GATA-1可以结合于miR-23a的启动子区，且随着分化过程中GATA-1的表达升高，在启动子区募集的GATA-1也随之增加，伴随而来的是RNA聚合酶II的进一步募集，从而激活miR-23a的转录。体外报告基因结果也显示，293T细胞中过表达GATA-1。可以显著激活包含有miR-23a启动子序列的报告基因的表达，而对于位点突变的启动子则没有此作用。进一步的功能试验显示，在K562细胞系和原代培养的CD34+造血干/祖细胞中过量表达miR-23a可以促进红细胞的分化发育，与此相反，抑制细胞内源性的miR-23a表达则减缓了红细胞成熟的速度。体内试验显示抑制miR-23a的表达使斑马鱼的红系发育受阻；而使用过量表达miR-23a的骨髓细胞通过尾静脉注射，在小鼠体内重建造血的过程中发现，与对照相比，miR-23a的高表达显著促进小鼠骨髓和脾脏中成熟红细胞的产生。另一方面，我们还鉴定了miR-23a的靶基因-SHP2，并通过“Rescue”实验证实miR-23a可以通过靶向抑制SHP2参与对红系分化的调节。综合以上结果，我们不仅获得了红系分化过程中GATA-1、EKLF、NF-E2对miRNA调节的整体线索，更对其中一条作用通路GATA-1-miR-23a-SHP2进行了深入研究，证实GATA-1对miR-23a的激活作用，以及miR-23a对SHP2的抑制作用，也分别验证了miR-23a和SHP2对红系发育成熟的重要调控作用。这些结果阐明miRNA自身表达调控因素的基础上，进一步丰富了我们对于红系分化基因表达调控网络的认识。