干热河谷地区猪屎豆根瘤菌多样性及其共生体系的抗旱机理研究

We proposed study on rhizobia collected and isolated from Crotalaria spp. which are grown in the region of dry-hot valley of China. This region located at the four rivers zones which are Nujiang, Lancang River, Yuanjiang River, Jinsha River. The ecological environment in this region with very prominent contradictions of water and heat are fragile, and the vegetation restoration is extremely difficult. The rhizobial strains will be collected and isolated first, then inoculated back to the original host legume and maintained. Genetic diversity and taxonomic relationships among these rhizobia will be revealed by PCR-based 16S rRNA RFLP and sequencing, 16S-IGS RFLP, SDS-PAGE of whole cell soluble proteins, BOX-PCR and symbiotic gene (nifH/nodABC) analysis. To determine the drought and heat resistance of those strains, we screen the physiological properties of these rhizobial strains in different temperature, pH, different NaCl concentration and PEG concentration.Inoculate those drought tolerance rhizobial strains to the host legume of Crotalaria spp., and compare the accumulated compounds such as betaine/choline/ Trehalose that response to the drought stress in rhizobia, nodules, host root tissue and host leaf tissue.The results in this study will demonstrate the genetic diversity of the rhizobia isolate from the Crotalaria spp. grown in the region of dry-hot valley and the drought tolerance mechanism of symbiotic system about rhizobia and Crotalaria spp.

本项目拟对我国怒江、澜沧江、元江、金沙江等干热河谷区的猪屎豆属植物的根瘤菌进行采集分离培养，经回接和根瘤菌菌株保存后，进行16S rRNA、结瘤基因nodABC、固氮基因nifH以及基因组IGS、ERIC、REP等序列遗传多样性的研究，确定根瘤菌菌株的分类和系统发育地位；通过测定这些根瘤菌株在不同温度范围、不同PH值、不同NaCl浓度及PEG浓度条件下的理化性质，筛选耐热抗旱的根瘤菌株，利用Northern 杂交从分子水平上进一步研究这些根瘤菌的抗旱性；利用这些抗旱根瘤菌株，构建具有高抗旱效率和高稳定性的豆科植物-根瘤菌共生体系，通过比较干旱胁迫下根瘤菌（耐旱和不耐旱的菌株）-根瘤-寄主根组织-叶组织内渗透调节物种类和数量的变化，探讨根瘤菌增强寄主植物耐旱性的生化互作机理，从而为干热河谷地带的生态恢复工程提供可筛选的根瘤菌资源及理论依据。

项目以云南干热河谷这个特殊地区的猪屎豆根瘤菌为材料，筛选耐热抗旱的根瘤菌株，并将筛选的抗旱根瘤菌回接到猪屎豆植物从生理角度探索其抗旱的机理，为干热河谷地带的生态恢复工程提供可筛选的根瘤菌资源及技术支持。研究结果如下：1. 从干热河谷地区分离获得供试菌株166株，经过16S rRNA基因序列分析，13株为根瘤菌，153内生细菌，分离的根瘤菌菌株所占的比例较低，后续将从采样的时间及分离方法上进行进一步分析原因。2. 13株根瘤菌分别属于Bradyrhizobium (10株)、Rhizobium (2株)和Ensifer (1株) 。持家基因atpD、recA和glnII 的系统发育学分析与16S rRNA基因分析结果基本一致。根据划分种属不同持家基因的相似性值，将这些根瘤菌归为7个种，显示了干热河谷地区猪屎豆根瘤菌具有非常丰富的遗传多样性。共生基因nodC 系统发育学分析发现遗传背景不同的根瘤菌却具有极高的nodC的序列相似性，表明根瘤菌在长期的进化过程中，发生了共生基因的横向转移。3. 153株内生细菌中发现了7个潜在的新种种群，对其中3个潜在新种种群进行了进一步的分类鉴定，证明其为一新种，分别命名为Microvirga crotalaria sp. nov.，Chryseobacterium crotalarii sp. nov., 和Chryseobacterium crotalarii sp. nov.，模式菌株分别为KLBC 81T, KLBC 52T 和KLBC 97T；4. 人工模拟干旱条件，对筛选的13株根瘤菌在下进行了抗旱性测定，发现菌株35、54和65属于高温干旱适应较强类型；5.选择抗旱性较强的菌株35回接到宿主植物猪屎豆中，共生后进行干旱胁迫，发现在干旱胁迫下，相对于不接种根瘤菌的猪屎豆，根瘤菌共生的猪屎豆能维持较高叶片相对含水量，具有较强的SOD和APX活性，能降低MDA产生速率以减少由于干旱缺水而造成的细胞膜损伤，显示出较强的渗透调节能力和活性氧防御能力，提高猪屎豆的抗旱能力。