牛分枝杆菌Erp蛋白突变体的构建及特性研究

牛结核病(bovine tuberculosis)是由牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis，MTB)引起的一种牛的慢性消耗性传染病。牛结核病的发生不仅对宁夏地区、全国乃至世界范围内养牛业的生产力造成了不同程度的负面影响，更重要的是对人类健康构成了严重威胁。Erp（exported repeated protein）是一种MTB夹膜蛋白，其特性与功能尚未十分清楚。本研究拟构建MTB Erp基因N端缺失、C端缺失以及PGLTS重复序列缺失、增加的多个突变体，并将其分别转染至鼠单核巨噬细胞株，利用2-D电泳技术，对不同细胞株的蛋白进行检测，寻找差异蛋白，对差异点进行质谱分析，并利用实时荧光定量PCR等技术对差异蛋白进一步进行验证，以期为进一步阐明Erp的作用机制与功能研究提供理论依据，为牛结核病的诊断与防制奠定基础。

本研究克隆获得了BCG erp基因，构建了erp多个突变体及相应的表达载体。原核表达产物的Tricine/SDS-PAGE检测结果表明，目的蛋白成功实现表达；生物信息学分析及Western blotting检测均表明重组蛋白ERP Mut C4、Mut N8和Mut CN4/8不能被ERP抗血清识别，表明ERP的基序数量、N端及C端均对其免疫原性有重要影响。真核表达载体转染至巨噬细胞，对差异蛋白因子的验证表明，pEGFP-N1-C21、pEGFP-N1-erp4/8/21、pEGFP-N1-CN4/8引起TLR-2、TLR-6、Myd88、TNF-α和IL-8等表达上调（P<0.05），其中pEGFP-N1-erp21引起的上调趋势最为明显；pEGFP-N1-C4/8、pEGFP-N1-N4/8/21、pEGFP-N1-CN21能够引起TLR-2、TLR-6、Myd88、TNF-α和IL-8等表达下调（P<0.05），其中pEGFP-N1-CN21引起的下调趋势最为明显。研究结果显示，所构建的erp系列突变体均能够引起巨噬细胞发生炎性反应，且差异较大，表明erp的N末端、C末端区域以及PGLTS串联重复序列氨基酸的种类和数目的差异对结核分枝杆菌的毒力均有较大的影响。研究结果为进一步阐明erp的作用机制与功能研究提供了理论依据，为牛结核病的诊断与防制奠定了基础。