MarP在牛分枝杆菌抗酸胁迫中的作用及机制研究

Mycobacterium bovis (M. bovis) is the causative agent of bovine tuberculosis, and the persistent infection and immune evasion mechanisms of M. bovis are unknown. Previous studies have shown that the IgG antibody titers against MarP in latent M. bovis-infected cattle are significantly higher than that in active M. bovis-infected cattle, and assumed that the MarP may play an important role in the latent infection of M. bovis. The transmembrane serine protease MarP is required for the resistance to acid stress in Mycobacterium tuberculosis, and promotes persistent infection of M. tuberculosis in activated macrophages. However, its natural substrate and the mechanisms for MarP protection M. tuberculosis from acid stress are unknown. This project conducts the following studies: to identify the natural substrate and its active site of MarP in M. bovis using Mycobacterium Tuberculosis Proteome Microarray, pull-down assay and etc.; to compare the survival ability and the MarP substrate expression levels between MarP deletion mutant and MarP complemented mutant; to analyze the effect of MarP on the maturation of phagolysosome in IFN-γ activated macrophages; to explore the effect and mechanisms of MarP in the resistance to acid stress of M. bovis. This study will contribute to illustrate the persistent infection and immune evasion mechanisms of M. bovis.

牛分枝杆菌是牛结核病的病原，其持续性感染和免疫逃避机制还不完全清楚。前期研究发现：潜伏性牛结核病动物血清中针对MarP的IgG抗体水平显著高于活动性牛结核病动物，推测MarP在牛分枝杆菌的潜伏感染中发挥重要作用。MarP是新近鉴定的与结核分枝杆菌抗酸、抗氧化胁迫作用相关的跨膜丝氨酸蛋白酶，能够促进结核分枝杆菌在免疫激活的巨噬细胞内长期生存，但其天然底物和抗酸机制尚未可知。本项目旨在通过结核分枝杆菌蛋白质组芯片、pull-down等技术鉴定牛分枝杆菌中MarP的天然底物及其活性区域；研究MarP的缺失/回补对牛分枝杆菌在酸性条件下和免疫激活的巨噬细胞内的存活、以及其底物蛋白表达水平的影响；研究MarP对IFN-γ激活的巨噬细胞中吞噬溶酶体成熟的影响，从而探讨MarP在牛分枝杆菌抗酸胁迫中的作用及机制，为阐明牛分枝杆菌的持续性感染和免疫逃避机制提供科学依据。

前期研究发现，潜伏期的结核病牛血清中针对MarP的抗体水平显著高于排菌期动物，推测MarP蛋白可能在牛分枝杆菌的持续性感染中起重要作用。本研究重组表达Rv3671c基因的胞浆区，即MarP蛋白，及其突变体MarP Ser343Ala，发现重组表达的MarP蛋白能水解β-casein，具有良好的丝氨酸蛋白酶活性，且可被DTT抑制，第343位的丝氨酸是其活性位点，该位点突变后无酶活性。利用分枝杆菌蛋白质组芯片和细菌双杂交系统，从4262个蛋白中鉴定到6个与MarP互作的蛋白，其中Rv1314c基因编码的脱氢酶具有氧化还原活性，可能协同参与牛分枝杆菌的抗酸胁迫。.本研究成功建立牛分枝杆菌基因敲除及过表达技术平台，构建Rv3671c基因缺失株（KO3671）、过表达株（pMV3671）和缺失回补株（COMP367），比较其与野生型菌株M.bovis AN5在不同培养条件下的生长曲线，发现Rv3671c基因与牛分枝杆菌抗酸胁迫能力和生长性能直接相关，KO3671菌株在pH4.5的柠檬酸-磷酸缓冲液4d的存活率仅为15.91%，而pMV3671存活率可达116%。在pH4.5和pH5.0的7H9培养基连续培养7-14天后，KO3671菌株调控其他抗酸胁迫通路，升高外环境的pH值，缓解酸性条件对菌体的杀伤作用。.以小鼠巨噬细胞系RAW264.7作为宿主细胞，研究Rv3671c基因对牛分枝杆菌在侵袭细胞和胞内存活的影响，发现IFN-γ增强巨噬细胞对牛分枝杆菌的吞噬和杀伤作用；Rv3671c基因能够增强牛分枝杆菌在感染早期抵抗巨噬细胞的吞噬和吞噬溶酶体的杀伤作用；在感染144小时后，KO3671菌株在巨噬细胞内通过调控其他通路，抵抗巨噬细胞的杀伤作用，促进其在细胞内的存活。.以小鼠作为感染动物模型，研究Rv3671c基因对牛分枝杆菌的致病力的影响。发现Rv3671c基因直接影响牛分枝杆菌的致病力，KO3671对小鼠的致病力非常弱，静脉注射感染小鼠8周后，小鼠的体重、脾脏和肺脏的系数比与健康对照组相当，且肺脏无病变、抗酸染色呈阴性，肺部载菌量低于5。本项目的研究结果对探讨牛分枝杆菌的免疫逃逸和持续性感染机制具有一定的指导意义和学术价值，对于抗结核药物靶点设计和结核病疫苗靶标筛选具有一定的参考价值。