尿素通道蛋白 B 与小分子抑制剂结合位点的确定

Urea transporters are a family of transmembrane proteins selectively permeable to urea and play an important role in urine concentration. Recently, urea transporter is proposed as a new diuretic drug target. Previous research in our laboratory shows that thienoquinolins, inhibitors of UT-B, exhibit strong diuretic effect without causing electrolyte imbalance and metabolic disorders, which suggests that UT-B inhibitors have the potential to be developed into novel diuretics. We predicted specific binding sites, key amino acids and binding mode of small-molecular UT-B inhibitors, such as, thienoquinolins interact with UT-B and validated by quantitative structure-activity relationship, molecular dynamics stimulation and structure analysis of different species UT-B. Basing on in silico prediction, this project intends to confirm the specific binding sites, key amino acids and binding mode of UT-B inhibitors interacting with UT-B protein using site-directed mutation technique and pharmacological evaluation. According to elucidated binding sites, novel UT-B inhibitors will be screened by computer virtual screening combined with UT-B inhibitor erythrocyte lysis screening model. Confirm the structure and activity of the inhibitors and the key chemical groups interact with UT-B protein. Construct the binding mode of UT-B and inhibitors. The aim of this study is to provide proof of concept and new hits for developing urea transporter inhibitor as novel diuretics.

尿素通道蛋白是特异性通透尿素的膜蛋白，在尿浓缩机制中发挥重要作用，可研发成为新的利尿药作用靶点。本实验室前期研究显示UT-B抑制剂噻吩并喹啉类化合物具有较强的利尿作用，且不引起电解质及代谢紊乱，具有开发成新型利尿药的潜力。我们前期工作应用计算机辅助药物设计方法预测了UT-B与噻吩并喹啉等小分子抑制剂的结合位点和结合的关键氨基酸以及结合方式，并以定量构效关系分析、分子动力学模拟和跨物种结构分析验证了这些抑制剂与UT-B作用的分子机制。本项目拟在此基础上，利用定点突变技术和化合物药效学评价，确认抑制剂在UT-B上的结合位点和结合的关键氨基酸；依据已确认的结合位点，利用计算机药物虚拟筛选结合UT-B抑制剂红细胞裂解筛选模型，筛选新的抑制剂，确认抑制剂构效关系及其与UT-B作用的关键化学基团，建立UT-B与其抑制剂的作用模型。本项目的目标是为研发尿素通道抑制剂类新型利尿药提供理论依据和线索化合物。

尿素通道蛋白是特异性通透尿素的膜蛋白，在尿浓缩机制中发挥重要作用，本实验室前期研究显示UT-B抑制剂噻吩并喹啉类化合物具有较强的利尿作用，且不引起电解质及代谢紊乱，具有开发成新型利尿药的潜力。.本项目利用实验室前期发现的尿素通道抑制剂建立了计算机虚拟筛选模型，并且分析抑制剂和尿素通道B(UT-B)的作用机制。以此为基础，筛选得到一类新的抑制剂Phenylphthalazines，体外具有UT-B抑制活性，并分析了该类活性最佳化合物PU1424与UT-B的作用方式。对已有抑制剂进行结构改造，获得噻吩并吡啶类化合物SAZcb-20，对人、大鼠和小鼠IC50分别为0.23μM、0.47 μM和 2.00 μM。体内利尿实验结果显示大鼠单次和多次皮下注射SAZcb-20表现出不同程度的利尿作用；尿渗透压及尿尿素浓度降低，且对血尿素、血糖、血脂均无显著影响，尤其不影响电解质平衡。Transwell实验证明SAZcb-20对UT-B和 UT-A1均有一定的抑制作用。但该类化合物口服未观察到利尿作用。.于是，我们利用建立的计算机虚拟筛选和红细胞尿素通道抑制剂筛选模型筛选出二芳基酰胺类化合物，有明显的UT-B抑制作用，对人、大鼠和小鼠UT-B 抑制IC50分别为1.60、0.99和0.25μmol/L。体内实验发现，灌胃给该类化合物后，小鼠尿量便增加，尿渗透压显著降低。连续灌胃给药7 天，给药组大鼠尿量相比对照组明显增加，渗透压明显降低，利尿效果较为稳定。.为了确认抑制剂和UT-B的作用机制，我们利用计算机辅助药物设计分析了二者的作用机制，预测了可能的作用位点，以此为依据建立了ASP280GLY、ASN289TRP、ALA337ARG三点同时突变慢病毒质粒。结果显示三个点突变后UT-B抑制剂PU-48不能抑制其尿素转运，说明PU-48与UT-B作用位点可能是ASN289TRP、ALA337ARG、ALA337ARG单个或二者或三者皆是。于是，建立了ASN289TRP、ALA337ARG和ASP280GLY单突变的UT-B MDCK细胞。结果显示，PU-48仍能抑制ASN289TRP、ALA337ARG和ASP280GLY单突变的MDCK尿素转运，说明尿素通道抑制剂不是单独作用于一个氨基酸，可能共同作用于ASP280GLY、ASN289TRP和ALA337ARG或者不同组合。