壳聚糖褐变降解的物质基础及其生物效应评价

Chitosan is a non-toxic, biocompatible natural cationic polysaccharide. It has been widly applied as hemostatic dressing, vascular stents, nerve conduits, and bone substitutes. But the browning degradation, a common problem of chitosan, limited the quality and application of chitosan. However, most reports discussed on the intense of browning and few focused on the material basis of browning degradation. The present project is planning to separate and identify the browning products of chitosan, illustrate degradation browning mechanism by studing the kinetics and the intermediates of browning. The safety of every main browning products and its effect to the coagulation system will be further studied based on the isolation of main browning products using prep-HPLC. Identification the material basis of chitosan browning products, explore their biological effects, including safety data and influence to the coagulation system, will provide a scientific basis for the understanding and evaluation the influence of browning products to the quality and function of chitosan. This will also provide the theoretical and technical basis for improving the quality control of the chitosan, and provide information for further study of the chitosan browning products.

壳聚糖是无毒、生物相容性好的天然阳离子多糖。它作为止血材料、血管支架、神经导管、骨替代物等方面已有大量的研究。褐变降解是影响壳聚糖质量的一个普遍问题。但目前对壳聚糖褐变降解研究围绕褐变程度进行，缺乏对壳聚糖褐变降解物质基础研究，对这些。本项目将建立壳聚糖中褐变产物的分离测定方法，鉴别主要褐变产物；通过降解动力学研究和中间产物研究阐明不同条件下壳聚糖主要褐变降解机理；采用制备液相等手段得到褐变降解产物对照品，评价褐变降解产物对壳聚糖安全性的及其对凝血系统的影响。阐明壳聚糖褐变产物物质基础及其安全性和对凝血系统的影响等生物效应，将为全面认识和评价褐变对壳聚糖的质量和功能影响提供科学依据；为完善壳聚糖的质量控制提供理论和技术基础，同时为壳聚糖褐变产物的进一步研究提供基础。

壳聚糖作为止血材料、血管支架、神经导管、骨替代物等方面已有大量的研究。壳聚糖在制备和处理中容易受热发生褐变降解，而影响其外观和质量。目前缺乏对壳聚糖褐变降解机理的研究及褐变降解对其生物活性影响、安全性影响的评价。.本研究首先建立了壳聚糖热降解产物的测定方法：包括氨基葡萄糖、壳二糖和壳三糖的柱前衍生HPLC测定法；果糖嗪和2，5-二脱氧果糖嗪亲水液相色谱法（HILIC）测定法；及5-羟甲基糠醛的HPLC测定法。这些方法专属，灵敏，检测限0.1-2.5μg/ml.同时采用LC-MS法鉴定了壳聚糖中特征降解产物T1。.分别以氨基葡萄糖、壳二糖、壳三糖、壳寡糖为模型分子，发现不同聚合度壳聚糖的加热褐变降解产物中氨基葡萄糖量较少且降解产物以T1为主，与氨基葡萄糖降解有较大差异。证实壳聚糖热褐变降解是以T1为特征产物的同时发生糖苷键断裂和还原端脱水、脱氨的过程。.采用毛细管法、试管法和肝溢血法等体内外方法，比较了褐变降解对于壳聚糖凝血特性的影响。发现热褐变降解0-12h的壳聚糖毛细管法凝血时间在33±15～43±20秒（n＝12），无显著差异（p>0.05）。试管法凝血时间在168±87～700±150秒（n＝10），热褐变降解2～8h凝血时间较0h更短（p<0.01）。肝溢血法凝血时间53±13～94±38秒（n＝6），热褐变降解0-12h的壳聚糖各组间平均凝血时间无显著差异（p>0.05）。表明壳聚糖热褐变虽然导致壳聚糖分子量降低（黏度值从60 Mpa.s 降至11.5 Mpa.s），但对其体内外凝血效果无显著影响。.研究还采用小鼠白血病单核巨噬细胞（RAW 264.7）和小鼠结缔组织成纤维细胞（L929）以MTT法评价壳聚糖褐变降解对其安全性的影响。.本研究建立了壳聚糖热褐变降解产物评价方法，证实了壳聚糖褐变降解机理，并阐明了壳聚糖褐变降解对其安全性和凝血活性等生物效应的影响，将为全面认识和评价褐变对壳聚糖的质量和功能影响提供科学依据；为完善壳聚糖的质量控制提供理论和技术基础，同时为壳聚糖生物材料的工艺和应用进一步研究提供基础。