Notch信号对人骨髓间充质干细胞增殖和向神经细胞分化中自噬发生的作用

自噬是细胞内蛋白降解的一种主要途径，有利于胞浆成分和细胞器的正常更新，但自噬在干细胞增殖分化中的作用和机制尚不清楚。Notch作为调控细胞增殖分化的最主要机制之一，可能调控自噬的发生。本项目通过构建Notch1真核表达载体和Notch1靶向SiRNA载体转染人骨髓间充质干细胞（human mesenchymal stem cell，hBMSC），Western-blot、RT-PCR、MDC自噬小体荧光染色及电镜定性定量、定位观察hBMSC在增殖和向神经细胞分化中自噬能力的变化；自噬增强剂雷帕霉素及自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤、渥曼青霉素处理间充质干细胞，用流式细胞仪检测自噬水平对hBMSC增殖，凋亡及细胞周期的影响，RT-PCR和免疫荧光检测hBMSC神经分化过程中Notch1信号活性的变化，以阐明自噬对hBMSC增殖和分化的影响以及Notch信号对hBMSC增殖和分化过程中自噬的

自噬作为细胞降解内源性蛋白质的一种机制，很可能参与到细胞增殖分化的过程中。Notch信号蛋白作为一种调节因子，遍及胚胎发育期的各种组织和各种成熟组织中未分化的具有增殖能力的细胞层，本实验研究了自噬对细胞增殖凋亡及分化的影响，及与Notch1信号途径之间的联系。结果表明: （1）采用雷帕霉素诱导骨髓间充质干细胞（BMSC）自噬水平增强后，细胞增殖受到抑制，S期比例减小，而3-MA处理组和氯喹组，S期细胞的比例增加，细胞凋亡率减小。（2）用雷帕霉素处理后BMSC后诱导其向神经细胞分化，所分化细胞中NSE阳性率增加，MAP2蛋白的表达也明显增加；而经3-MA、氯喹处理后的BMSC，其神经分化细胞中NSE阳性率减小，同时MAP2的表达也降低。（3） 雷帕霉素诱导组Notch1平均荧光强度降低，Notch1和Hes1蛋白的表达下降。（4）构建Tet-on调控的携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的人源性Notch1胞内段(Notch1 intracellular domain,NICD)融合蛋白的慢病毒真核表达载体，成功建立四环素基因表达系统调控Notch1-EGFP- PC12细胞模型。NOTCH1平均荧光强度在DOX诱导36h达到最高。（5）DOX诱导Notch1-EGFP- PC12细胞表达Notch1蛋白0h,12h,24h,36h,48h,60h，其S 期细胞比例逐渐降低, 凋亡率逐渐升高。（6）自噬相关蛋白Beclin1,Atg5,Atg7,LC3B 在诱导36h表达量最高，与Notch1表达量具有相关性。我们的结果表明自噬影响BMSC细胞增殖及神经分化，且与Notch1信号途径相关；PC12细胞高表达Notch1蛋白抑制细胞增殖，且Notch1表达水平与自噬相关。