超声微泡介导RNA干扰结缔组织生长因子在肾间质纤维化中的作用研究

The incidence of chronic renal disease(CRD) is increasing year by year,renal interstitial fibrosis(RIF)?is the common pathologic change of CRD progressing to end-stage renal diseases (ESRD).As an important downstream effector of profibrotic factor TGF-β1, CTGF is more specific for its single role. Though it is reported that CTGF as a target for treatment can ameliorate RIF, there are still many problems resulting in poor effect of treatment in the field of gene therapy. Whill it is found that microbubble can be used as an efficient and safe vector for delivery gene or drug,ultrasound-targeted microbubbles destruction (UTMD) can enhance the purpose gene transfection,but the role in RIF remains need to be explored. Thus,we propose a hypothesis, UTMD could mediate and enhance CTGF interference gene transfection to ameliorate RIF.In this study, we attempt to use UTMD and RNA interference (RNAi),carry plasmid of shRNA targeted CTGF with cationic microbubbles,use rats kidney fibroblast cell lines and rats model with RIF,to explore the effect of UTMD in mediating and enhancing plasmid transfetion,explain the mechanism of UTMD mediated CTGF-shRNA plasmid transfection in ameliorating RIF, in order to provide a new safe and effective idea and method for preventing the process of RIF.

慢性肾脏疾病发病率逐年增加，肾间质纤维化是各种肾病进展至终末期肾衰竭的共同通路，结缔组织生长因子（CTGF）作为促肾纤维化因子TGF-β1的重要下游效应因子，其作用单一，特异性更强，研究表明以CTGF作为靶点的治疗方法能改善肾间质纤维化，但基因治疗领域仍存在诸多问题导致治疗效果不甚理想，微泡可作为一种高效安全的基因或药物载体,超声靶向微泡破坏（UTMD）可增强目的基因转移，但在肾间质纤维化中的作用还有待于进一步探讨，为此我们提出假说，UTMD可介导CTGF干扰基因转移而延缓肾间质纤维化。我们试图将UTMD与RNAi技术结合，利用阳离子脂质体微泡负载CTGF-shRNA质粒，通过肾大鼠成纤维细胞系和肾间质纤维化模型，探讨UTMD对质粒转染的增效作用，阐明UTMD介导CTGF-shRNA质粒转染对肾间质纤维化的干预作用机制，以期为肾间质纤维化的治疗提供一种新型安全及有效的思路和方法。

肾间质纤维化是各种慢性肾病终末期的共同病理表现，结缔组织生长因子(CTGF) 是促肾纤维化因子TGF-β1的重要下游效应因子，其作用单一，特异性更强，可作为肾纤维化治疗的重要靶点。基因治疗领域仍存在诸多问题导致效果不甚理想，微泡可作为一种高效安全的基因或药物载体，超声靶向微泡破坏（UTMD）可增强目的基因转移，本研究探讨UTMD技术介导CTGF-shRNA质粒转染对肾间质纤维化的作用。首先设计及合成CTGF-shRNA的表达质粒并与阳离子微气泡结合，通过超声微泡介导CTGF-shRNA质粒转染的体外细胞实验筛选出最佳CTGF-shRNA序列用于后续实验。建立单侧输尿管梗阻（UUO）小鼠模型，通过实时荧光定量PCR检测假手术组肾及建模后3天、6天、9天、12天、2周、3周、4周梗阻肾CTGF mRNA的相对表达量，结果表明CTGF mRNA的表达量随着建模天数的增加而升高，在建模后2周达到峰值，随后下降并呈现稳定趋势。因此于建模后第3天将小鼠随机分为六组进行实验，分别为假手术组（Sham），UUO模型组（UUO），UUO+单纯质粒组（P），UUO+质粒和微泡组（P+MB），UUO+质粒和超声辐照组（P+US）及UUO+质粒和UTMD组（P+UTMD）。于建模后14天处死小鼠，通过实时荧光定量PCR和Western blot检测各组肾脏CTGF及TGF-β1的mRNA和蛋白表达，通过免疫组化检测各组肾脏CTGF、TGF-β1、α-SMA及Type I college 表达，通过HE染色及masson染色观察肾间质纤维化改变。与UUO组比较，P+UTMD组CTGF及TGF-β1的mRNA和蛋白表达水平显著下调(P<0.05)，而其他处理组较UUO组差异无统计学意义(P>0.05)，免疫组化结果表明， P+UTMD组CTGF、TGF-β1、α-SMA及Type I college 表达较UUO组明显减少（P<0.01），而其他处理组较UUO组差异无统计学意义（P>0.05）。HE染色及Masson染色结果显示P+UTMD组肾间质纤维化程度较UUO组减轻（P<0.01），而其他处理组较UUO组差异无统计学意义（P>0.05）。超声靶向微泡破坏技术能有效介导CTGF-shRNA转染UUO小鼠肾脏，沉默CTGF表达，为肾间质纤维化提供了一种无创、有效的非病毒转染的基因治疗方法。