超声联合微泡-载药纳米粒复合体激动PPARγ抗肾间质纤维化的实验研究

PPARγ agonists as thiazolidinediones can delay the process of renal chronic disease represented by renal interstitial fibrosis (RIF), while these drugs have poor water solubility and many side effects. Ultrasound targeted microbubble destruction (UTMD) is considered as a high efficiency and low toxicity method for targeting drug delivery and mediating gene transfection, in our previous study, we used this technology mediating gene transfection in a mouse model with RIF. However, as drug carriers, microbubbles have low drug loading efficiency and unstable performance, thus, we propose a hypothesis, PPARγ agonists can be loaded by nanoparticles which linking with microbubbles, this complexes can not only hold the high drug loading efficiency, but also promote PPARγ agonists delivery to targeted cells using UTMD technology, then play the role of improving RIF. In order to verify this hypothesis,we will use the PLGA nanoparticles encapsulated PPARγ agonists rosiglitazone, and the drug loaded nanoparticles will be covalently linked to albumin microbubbles, the mouse renal tubular epithelial cells will be used to evaluate their biological properties in vitro, and unilateral ureteral obstruction mouse model of RIF will be used in vivo. The activation of PPARγ and expression of RIF related factors will be evaluated using methods as real-time fluorescence quantitative PCR, western blot and immunohistochemical. This study is aimed to provide a novel method of targeted drug delivery for the treatment of RIF.

PPARγ激动剂噻唑烷二酮类药物可延缓肾间质纤维化（RIF）为代表的肾慢性疾病进程，但此类药物水溶性差，副作用多。超声靶向微泡破坏（UTMD）技术被认为是一种高效低毒的靶向给药和介导基因转染的方法，我们前期研究曾将该技术介导基因转染用于RIF小鼠模型，但微泡作为药物载体载药量不高且性能不稳定，为此我们提出假说，通过纳米粒子包载PPARγ激动剂并偶连微泡，既保证高的载药量又可利用UTMD技术促进药物向靶细胞递送，从而发挥其抗RIF的作用。为验证该假说，本研究拟利用PLGA纳米粒包载PPARγ激动剂罗格列酮，并与白蛋白微泡化学共价连接构建微泡-载药纳米粒复合体，通过小鼠肾小管上皮细胞体外评价其生物性能，通过单侧输尿管梗阻的RIF小鼠体内实验，利用实时荧光定量PCR、westernblot及免疫组化等方法观察PPARγ激活及RIF相关因子表达情况。本研究将为RIF治疗提供一种新型的靶向给药方法。

肾间质纤维化（RIF）是各种慢性肾病终末期的共同病理表现，探索有效的干预RIF方法对延缓终末期肾衰竭进程有重要的临床意义。PPARγ激动剂噻唑烷二酮类药物可延缓RIF为代表的肾慢性疾病进程，但此类药物水溶性差，副作用多。超声靶向微泡破坏（UTMD）介导的药物靶向递送是一种新的方法，但微泡作为药物载体载药量不高且性能不稳定，而纳米粒子具有载药量高、作用时间长、药物缓释性好等优点，为此，本研究通过纳米粒子包载噻唑烷二酮类药物罗格列酮（RSG）并偶连微泡，探讨超声辐照联合微泡-载药纳米粒复合体激动PPARγ对RIF的作用及机制。. 研究采用聚乳酸羟基乙酸共聚物（PLGA）纳米粒负载RSG，制备PLGA-RSG纳米粒（PLNPs-RSG），再加入PEI溶液进行电荷修饰，将Sonovue微泡（MBs）与PLNPs-RSG通过静电吸附作用制备PLNPs-RSG-MBs复合物。检测其粒径分布、zeta电位、载药量和包封率，测定RSG的释放量，并进行体外细胞毒性和体内生物毒性试验。在超声辐照下，利用激光共聚焦显微镜（CLSM）评估PLNPs-RSG-MBs复合物的细胞摄取，利用近红外（NIR）荧光成像系统评价其体内生物分布。之后将PLNPs-RSG-MBs复合物联合超声辐照应用于单侧输尿管梗阻（UUO）大鼠模型。. 结果表明，PLNPs-RSG-MBs复合物的粒径为2199.5±988.1nm，载药率为28.5%，且具有较好的均一性和分散性。体外细胞毒性和体内生物毒性实验结果表明，该复合物具有良好的生物相容性。在超声辐照的辅助下，PLNPs-RSG-MBs复合物在体外表现出较高的细胞摄取效率，在体内实验中对肾脏组织有良好的靶向性。在UUO大鼠模型中，PLNPs-RSG-MBs复合物联合超声辐照使PPARγ的mRNA和蛋白表达明显上调，同时，TGF-β1、α-SMA和Collagen I的mRNA和蛋白表达明显下调，显著减少了胶原沉积，有效地减轻了肾纤维化。. 因此，PLNPs-RSG-MBs复合物与超声辐照联合应用为RIF的治疗提供了一种新的安全有效的方法。