平滑肌祖细胞促进组织工程膀胱平滑肌再生的作用及机制研究

膀胱是一个具有舒缩功能的肌性器官，组织工程膀胱的关键是膀胱平滑肌的再生。目前，缺乏理想的平滑肌种子细胞是制约组织工程膀胱研究和应用的主要因素之一。前期研究中，课题组建立了外周血平滑肌祖细胞(SPC)的分离和培养技术，为组织工程膀胱提供了一种新的种子细胞来源。在此基础上，课题组将以兔为动物模型、自体SPC为种子细胞、自主研制的"多孔的保留有生物活性因子的猪膀胱无细胞基质(BAM)"为支架材料，将SPC接种到BAM上复合培养后再进行膀胱部分替代，然后从结构和功能两方面观察SPC促进组织工程膀胱平滑肌再生的作用。课题组还将进一步探讨SPC促进组织工程膀胱平滑肌再生的直接与间接机制:1.SPC是否直接参与组织工程膀胱的平滑肌再生、整合到膀胱平滑肌中；2.SPC是否旁分泌生物活性因子、上调膀胱平滑肌细胞的活性、间接促进组织工程膀胱的平滑肌再生。本课题将为组织工程膀胱从实验室到临床的转化奠定基础。

过去的二十年里，组织工程膀胱领域的研究取得了突破性的进展。由于平滑肌在膀胱的储尿和排尿功能中发挥了重要的作用，而目前仍缺乏理想的膀胱平滑肌种子细胞。本课题从这一难点出发，旨在为组织工程膀胱研究寻求一种理想的种子细胞，以促进膀胱平滑肌再生、血管化以及膀胱功能的恢复，并对其作用机制做了相关研究。.首先，我们成功地分离和培养了兔外周血平滑肌祖细胞（SPCs），以兔膀胱平滑肌细胞（RBSMCs）作为阳性对照，采用流式细胞术、免疫荧光、real-time PCR、单细胞成克隆技术等对SPCs进行鉴定，结果表明SPCs不仅可表达RBSMCs特征性的基因和蛋白标记如SMA、Desmin、Calponin、SM22和SMMHC等，还可表达干/祖细胞的标记KDR、CD133、CD29和CD90，同时还具有祖细胞的特征，增殖能力强。将分离出的SPC还可在卡巴胆碱刺激下产生收缩反应，进一步证明其具有平滑肌的特性。.其次，我们采用细胞生物学方法，在体外观察了SPCs对RBSMCs的作用，研究结果表明，SPCs可以分泌血小板衍生生长因子-BB（PDGF-BB），通过旁分泌机制促进RBSMCs的增殖、迁移和刮伤愈合。.第三，我们采用荧光染料CM-DiI标记SPCs，通过免疫荧光和流式细胞术分析，CM-DiI标记率为96％左右，连续传代2周后标记率仍在40％以上。标记后的细胞存活率无明显降低，细胞粘附能力、增殖能力和迁移能力无明显改变。将细胞种植到膀胱无细胞基质（BAM）上，通过组织学染色可发现，SPCs可快速长入BAM中。此外，PDGF-BB可以促进SPCs在BAM中的生长，呈剂量依赖性。.最后，我们以BAM作为支架材料，以SPCs作为种子细胞，以兔为实验动物，进行膀胱替代，观察SPCs促进组织工程膀胱再生和功能恢复的作用。结果显示，术后1月时两组替代区域的边缘区和中心区的尿路上皮细胞均已再生良好。在术后各时间点，实验组中替代平滑肌束密度、微血管密度和数目以及神经束的再生均明显高于对照组（P<0.05），但两组中的替代中心区神经束的再生无明显差异。实验组的膀胱功能恢复明显优于对照组（P<0.05）。同时，通过荧光示踪表明，SPCs还直接参与构成了再生膀胱的平滑肌组织。研究结果表明，采用SPC作为种子细胞进行膀胱替代重建，可以显著地促进组织工程膀胱平滑肌再生、血管化和神经再生，并促进膀胱功能的恢