可编程的核酸适配体荧光探针的构建及其在细胞膜蛋白时空分辨成像中的应用

Membrane proteins are important cancer biomarkers and the interface of the intracellular and extracellular environments, playing key role in the process of intracellular functional regulation. Therefore, they have become an important basis for cancer diagnosis and the key subject of molecular biology research. However, the conventional fluorescent imaging probes often functioned in an uncontrolled way, limiting the further study of the membrane proteins’ dynamic behaviors. To solve this problem, this research program will construct a novel type of aptamer probes with binary chimera structure, thus regulating the fluorescent imaging signals in a programmable manner. These binary probes are based on two moieties: one aptamer for sensing, the other for signals' regulation. The signals regulation’ moiety will use one strategy named toehold-mediated DNA strand displacement, taking advantage of its great ability to construction of senior programmable molecular switches. These programmable aptamer fluorescent probes will be used for intelligent imaging of membrane proteins in a spatiotemporal mode, thus exploring new applications of aptamers in fluorescent imaging research of cells. They may meet various needs to study membrane proteins’ dynamic behaviors, such as the membrane protein-mediated internalization, multiplexed probing of living cells, spatially distributed imaging and so on. This issue is expected to establish a novel intelligent imaging approach with good biocompatibility and high stability in cellular environments, overcoming aptamers’ limitations of little functions and difficulties in spatiotemporal imaging. It will also enrich the design of novel DNA molecular devices and expand their new applications in biological system.

膜蛋白是细胞内外信息沟通和功能调控的媒介，也是癌细胞重要的生物标志物，已经成为分子生物学研究的重要对象和癌症诊断的基本依据。然而，目前传统的细胞荧光成像策略无法实现对成像信号的可控调节，从而限制了对细胞膜蛋白动态行为的研究。针对这一问题，本项目拟将利用支点介导的DNA链置换策略在可编程分子开关设计上的优势，拟构建具有二元嵌合物结构的新型核酸适配体荧光探针，将实现对荧光成像信号的程序化可控调节。尝试将该类荧光探针用于细胞膜蛋白时空分辨的智能化荧光成像，期望满足膜蛋白动态行为研究的需求，包括膜蛋白介导的细胞内吞、多目标成像和空间分布成像等研究内容，以探索核酸适配体在细胞荧光成像领域的新应用。本项目有望建立生物相容性好、稳定性高的智能型细胞成像探针的新方法，突破荧光成像探针功能单一和时空分辨成像困难等方面的局限，也将丰富新型DNA分子器件的设计并拓展其在生物体系的应用前景。

1、背景：细胞膜蛋白是细胞内外信息沟通和功能调控的重要媒介，同时也是癌细胞重要的生物标志物，已经成为分子生物学研究的重要对象和癌症诊断的基本依据。荧光成像技术是研究细胞膜蛋白表达量和功能的重要手段，具有高灵敏、能原位实时监测、多重正交、可视化等特点，也是生物分析化学的研究热点之一。核酸适配体被称为“人工抗体”，可以识别细胞膜蛋白，在荧光成像研究领域得到了广泛应用。. 然而，目前传统的细胞荧光成像策略无法实现对成像信号的可控调节，从而限制了对细胞膜蛋白动态行为的研究。在之前研究工作中，为了调控核酸适配体的荧光成像信号，往往会采用胰酶消解的方法，但是这样会破坏细胞膜蛋白的结构，不利于细胞后续的研究工作。. 2、主要研究内容：为了解决这一问题，本项目利用支点介导的DNA链置换策略，在可编程分子开关设计上的优势，构建了具有二元嵌合物结构的新型核酸适配体荧光探针，成功地实现了对荧光成像信号的程序化可控调节。本项目详细考察了该荧光成像探针的设计结构，优化了其序列，研究了其荧光动力学响应行为，并采用电泳的方法验证了其响应机理。最后，我们采用荧光共聚焦成像的方法，详细研究了该类荧光探针的细胞成像性能。. 3、重要结果和关键数据：该类荧光探针可以用于细胞膜蛋白时空分辨的智能化荧光成像，实现了膜蛋白动态行为的研究。首先，实现了细胞膜蛋白的可逆荧光成像研究，可以通过外加DNA来控制荧光成像信号的开关，开关次数达到4次；其次，实现了双目标可控荧光成像，可以通过外加DNA来选择性猝灭其中一个荧光信号，并对比了胰酶消解方法的结果，证实了本项目设计的荧光探针更有优势；其次，我们构建了具有逻辑“与”门响应的荧光探针，实现了通过两个不同的DNA协同激活荧光成像；最后，我们还研究了该荧光成像探针对空间分布的监测性能，我们发现该探针能监测不同的DNA在不同介质中的顺序问题，这也是第一个具有这一独特性能的荧光探针。. 4、科学意义：本项目建立了生物相容性好、稳定性高的智能型细胞成像探针的新方法，突破了荧光成像探针功能单一和时空分辨成像困难等方面的局限，丰富了新型DNA分子器件的设计并将拓展其在生物体系的应用前景。