双光子核酸荧光探针的研制及其在活细胞成像中的应用

Currently, the status that two-photon fluorescence microscopy lacks of excellent two-photon fluorescence probes in the three-dimensional imaging detection of cells and tissues is an urgent problem to solve. The nucleic acids are important biological macromolecules in cells, and the quantitative analysis and specific recognition of nucleic acids have very important significance to the development of genomics, virology, molecular biology, and other related disciplines. This project involves the research work of the preparation and cell imaging of two-photon nucleic acids fluorescent probes, including DNA and RNA probes. On the basis of the preliminary work, we design, synthesize and characterize the two-photon DNA and RNA fluorescence probes, explore the inherent rules that cationic organic molecules specially recognize DNA or RNA and the influence of molecular configuration on specific recognition ability, master the regulation rules of DNA and RNA probes, and eventually reach the targets of producing high-performance nucleic acids probes. Concrete targets of properties of two-photon fluorescence probes have been proposed, such as the binding induced two-photon excited fluorescence action absorption cross section and binding constant. Two-photon DNA fluorescence probes could accurately image the cell nucleus in fixed and living cells of plants and animals, while two-photon RNA fluorescence probes could successfully image the RNA in nucleolus or/and cytoplasm.

目前，双光子荧光显微镜在细胞和组织三维成像检测中缺乏优良双光子荧光探针的现状是一个亟待解决的问题。核酸是细胞中重要的生物大分子，其定量分析、特异识别对基因组学、病毒学、分子生物学等相关学科的发展具有十分重要的意义。本项目针对核酸开展包括DNA及RNA在内的双光子核酸荧光探针的制备及其细胞成像方面的研究工作。基于前期工作，本课题通过双光子DNA和RNA 荧光探针的设计、合成及表征，探索阳离子有机分子专一性识别DNA或RNA的内在规律、分子构型对专一性识别能力的影响，掌握DNA和RNA探针的调控机制，最终达到制备高性能核酸探针的目标。课题对双光子核酸荧光探针的结合诱导双光子荧光活性吸收截面及结合常数等性能提出了具体指标，双光子DNA荧光探针能够在动植物的固定及活细胞中准确成像细胞核，而双光子RNA荧光探针能够准确成像核仁区以及细胞质中的RNA。

在生物细胞中，核酸是重要的生物大分子，主要有DNA和RNA组成，其定量分析、特异识别对基因组学、病毒学、分子生物学等相关学科的发展具有十分重要的意义。双光子显微成像技术具有高的检测灵敏度、大的穿透深度、无成像扭曲、低的光毒性和光漂白性等特点，在生物细胞、组织的活体成像方面具有独特优势。但当前优良双光子荧光探针的缺乏，很大程度上制约了双光子显微成像技术的广泛应用。因此，研制有效的适用于活体观测的双光子DNA和RNA荧光探针具有重要的意义和巨大的应用前景。. 在本项目研究中，我们利用Vilsmeier、Knoevenagel缩合等反应合成了两类双光子核酸荧光探针：五个双光子RNA荧光探针（DMTI、DHTI、DMI、IMT-E、IMT-M）以及三个双光子DNA荧光探针（EIT-M、EIT-E、CMT-E）。本研究通过核磁共振谱、质谱等手段对探针分子结构进行了表征，并详细分析了探针在不同溶剂中以及与核酸结合后的紫外吸收光谱、单光子荧光光谱和双光子荧光光谱，结果表明：探针与核酸作用后，其荧光强度均大幅度提升，应为“光开关”型双光子荧光探针。利用荧光成像技术对探针在活细胞成像中的应用进行了分析，结果表明：两类探针均能用于活细胞成像，RNA探针可特异性识别核仁和细胞质区域RNA并得到清晰的双光子荧光成像，而DNA探针则可以精确地标记细胞核，实现细胞核区DNA的双光子荧光成像。. 本项目所涉及的核酸探针合成路线简单，易于操作，便于推广，具有双光子性能优良、膜通透性好、生物毒性低、识别性强、光稳定性好等特点，在双光子RNA或DNA生物成像方面具有切实应用价值，将会有很好的应用前景。