mlncR8和mlncR31调控毛地黄苷合成的分子机制

The main active ingredients of Digitalis purpurea are cardiac glycosides (cardenolides), which have been proved to be the most effective drugs to treat congestive heart failure. The putative biosynthetic pathway of plant cardiac glycosides roughly comprises terpenoid backbone biosynthesis, steroid biosynthesis and cardenolide biosynthesis three stages, in which both 4-Hydroxy-3-methylbut-.2-en-1-yl diphosphate synthase (HDS) and Solanesyl diphosphate synthase (SPS) are key enzymes for terpenoid backbone biosynthesis,while the regulartory mechanism is not clear. mlncRNAs（mRNA-like non-coding RNAs）are a subset of long noncoding RNAs (lncRNAs), which play an important role in plant growth and development and stress response. We have found that mlncR8 interacted with HDS and mlncR31 interacted with SPS. Recently, small interfering RNAs(siRNAs) were found in the homologous region beteen mlncR8 and HDS by high-throughout small RNA libiary sequencing. While mlncR31 did not produce siRNAs. In this project,the full length of mlncR8, mlncR31, HDS and SPS genes will be cloned. Then expression vectors will be constructed and introduced into D. purpurea by agrobacterium-mediated transformation. Morphology, product analysis and gene expression profiling will be analyzed for transgenic plants. In addition, action of siRNAs produced by mlncR8 will be shown by degradeome sequencing and other methods. The interaction between mlncR31 and SPS will be detected by yeast three-hybrid system. Results will reveal the regulartory mechanism of mlncRNAs in cardiac glycosides synthesis and provide the basis for breeding new cultivars for D. purpurea.

毛地黄(Digitalis purpurea L.)主要活性成分为毛地黄苷，是治疗充血性心力衰竭的最有效药物，其合成包括萜类骨架、类固醇及强心苷合成三阶段，4-羟基3-甲基2-烯-1-丁基二磷酸合成酶（HDS）和茄呢酰二磷酸酯合酶（SPS）是萜类骨架合成关键酶，但调控它们的机制不清楚。mlncRNA是长链非编码RNA的一种，在植物生长发育及胁迫响应中发挥重要作用，前期筛选出mlncR8和HDS互作，mlncR31和SPS互作，高通量小RNA库测序发现mlncR8与HDS同源区产生小干涉RNA，而mlncR31不产生。本项目拟克隆上述基因全长，构建表达载体并转化毛地黄，对转基因植株进行形态鉴定、产物检测及表达谱测序。降解组测序等方法分析mlncR8的siRNA作用方式；酵母三杂交检测mlncR31与SPS互作。本研究将有助于揭示mlncRNA调控毛地黄苷合成的分子机制，为培育新品种奠定基础。

毛地黄苷是治疗充血性心力衰竭的最有效药物，其合成包括萜类骨架、类固醇及强心苷合成三阶段，4-羟基 3-甲基2-烯-1-丁基二磷酸合成酶（HDS）和茄呢酰二磷酸酯合酶（SPS）是萜类骨架合成关键酶，但调控它们的机制不清楚。mlncRNA是长链非编码 RNA的一种，在植物生长发育及胁迫响应中发挥重要作用，前期筛选出 mlncR8和 HDS互作，mlncR31和 SPS互作，高通量小 RNA库测序发现 mlncR8与HDS同源区产生小干涉RNA，而 mlncR31不产生。在此基础上，本项目克隆了HDS、lncR8和SPS基因的全长，构建了这三个基因的过量表达和干扰载体，通过转基因等手段正在分析它们的分子机制。我们建立了毛地黄混合器官的降解组库，并进行了测序，分析发现mlnc8产生的小干扰RNA（siRNA）不作用于HDS基因。本研究将有助于揭示 mlncRNA调控毛地黄苷合成的分子机制，为培育新品种奠定基础。已知的lncR31基因序列较短而且与SPS基因有高度的同源性，通过RACE扩增其全长序列比较困难，为此我们构建了毛地黄链特异性转录组文库，并进行了高通量测序，结果还是没能得到更长的mlncR31的序列，最后放弃了该基因的克隆。原因可能是mlncR31基因表达具有组织特异性和时空性。. 基于毛地黄链特异性RNA-Seq数据，我们建立了分析可变剪接的方法，并进行了系统分析，共发现了3265个可变剪接基因，5408个事件。其中，2442个可变剪接事件发生在编码区，959个位于882个蛋白质结构域，参与毛地黄苷合成的4个UDP糖基转移酶和12个单加氧酶基因也发生了可变剪接。基于毛地黄链特异性RNA-Seq数据，还鉴定出了2271对反义转录本，其中有182对在双链上都能够产生siRNA。. 基于在毛地黄长链非编码RNA的研究经验，我们首次在灵芝中鉴定出了402个lncRNA，发现了16个lincRNA可能调控灵芝生长发育及次生代谢产物合成相关的15个编码基因。此外，我们还建立了与活性成分合成相关的细胞色素P450（CYP450）家族基因的预测方法和数据库；首次在植物中发现了对称性RNA编辑现象，丰富了基因转录后调控理论。