黄芪三萜皂苷类生物合成分子机制调控的研究

Triterpenoid saponin is a vital secondary metabolite exist in medicinal plant Astragalus mongholicus. On account of elicitor's regulation of its biosynthetic pathway, we approached elicitor's regulatory mechanism with changes of the contents in Astragalus metabolites by research of intracellular signal substances, signal transmission, and interaction of the signal substances. As are functional genes of key enzyme exist in synthesis pathway of triterpenoid saponin，full-length sequences were cloned using reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) and rapid amplification of cDNA ends, structures of functional genes were analyzed and the occurrence was identified in Astragalus genome; In using of fluorescent quantitative PCR，spatial and temporal expression characteristics of functional genes in the synthesis process of the triterpenoid saponins were investigated ; Preliminary，we understood how they worked in the biosynthesis of triterpenoid saponins by subcellular localization of the functional genes with the technology of confocal fluorescence; Sense and antisense carriers of functional genes were both constructed to analyze genetic transformation. In this way can we check the function of genes in Astragalus triterpenoid saponin biosynthesis. With mode plant genetic transformation by Agrobacterium，organizations of specific gene expression were confirmed，over expression and regulation were verified, meanwhile，the mechanism of the endogenous elicitor regulation of key synthase genes expression was established. All of the work committed to the establishment of Astragalus triterpenoid saponins bioreactor.

三萜皂苷是药用植物黄芪重要的次生代谢产物，利用诱导子对其生物合成途径进行调控，通过其对胞内的信号物质、传递信号、及信号物质间的互作等内容研究，探讨诱导子对植物黄芪代谢产物含量变化的调控机制。利用逆转录PCR和cDNA 末端快速扩增技术，对黄芪三萜皂苷合成途径关键酶功能基因进行全长序列克隆，分析功能基因的结构和在黄芪基因组中存在情况；利用荧光定量PCR技术研究功能基因在三萜皂苷合成过程中的时空表达特性；利用荧光共聚焦技术对功能基因进行亚细胞定位，初步明确其如何参与三萜皂苷的生物合成；构建功能基因的正义和反义载体，对黄芪进行遗传转化研究，进一步明确功能基因在黄芪三萜皂苷生物合成过程中的作用。利用农杆菌介导技术转入模式植物中，建立转化体系，确定功能基因特异表达的组织，对其超表达及调控功能进行验证,从而建立了内源诱导子调控关键合成酶基因表达的机制，为建立黄芪三萜皂苷生物反应器奠定理论基础。

黄芪（Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge.）是中国北方的重要药用植物，广泛应用于临床。本试验对黄芪次生代谢途径调控诱导子以及黄芪转录组的生物信息学进行研究，筛选出相应代谢途径的诱导子，获得参与调控的关键基因和转录因子，为通过基因工程手段调控次生代谢途径，提高黄芪次生代谢物质的含量提供理论指导和技术支持。本研究利用正交试验设计，以黄芪多糖含量、黄芪皂苷含量、黄芪黄酮含量为衡量指标，对调控相应代谢途径的诱导子进行了筛选，确定了最佳诱导子，最佳处理部位及处理时间。同时本研究利用454/Roche GS FLX测序技术对黄芪植株根、茎、叶等比例总RNA混样进行了1/2板的转录组从头测序。这1/2板的测序共得到742721条高质量reads，通过比对共得到9893个unigene，9732个unigene被成功注释，注释率为98.37%。利用KEGG对unigene进行功能分类和代谢通路分析，其中2877个unigene归入45条代谢路径。在参与黄芪生物活性物质代谢的多糖代谢途径中找到36条unigene，皂苷和黄酮相关的代谢途径中找到68条相关的unigene。在黄芪转录组12880个转录本中发现1729个SSR位点，平均距离是7.97kb，包含了从单核苷酸类型到六核苷酸的六种不同类型，核心重复序列127种。利用诱导子技术对植物毛状根中次生代谢产物生物合成进行调控，已成为筛选植物次生代谢活性成分生物合成路径中关键酶基因最行之有效的方法。本研究成功建立了一个高效快速的体外黄芪毛状根诱导体系，系统筛选出了高产皂苷和异黄酮类活性成分的黄芪毛状根株系，并通过PCR分析实现对其分子鉴定。同时利用相关数理统计实验设计和动力学模型，系统优化了黄芪毛状根的液体培养条件，并对其中皂苷和异黄酮次生代谢活性成分进行了LC-MS/MS定性和定量分析检测。然后通过外源理化和生物诱导子胁迫处理黄芪毛状根培养体系，利用LC-MS/MS技术分析诱导处理前后黄芪毛状根中皂苷和异黄酮类活性成分含量的变化规律，并结合qRT-PCR技术分析诱导处理前后黄芪毛状根中皂苷和异黄酮生物合成酶基因的表达差异性规律，最终初步阐明黄芪中皂苷和异黄酮类次生代谢活性成分生物合成路径中的关键调控酶基因。